酶標(biāo)抗體染色方法

　　一、本科標(biāo)抗體法

　　酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價鍵將酶連結(jié)在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。

　�。ㄒ�)酶的種類及特點

　　從理論上講，用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體，進(jìn)行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多�，F(xiàn)將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。

表4-1 免疫細(xì)胞化學(xué)常用的酶

　　Sternberger(1986)指出，用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存1～2年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（Turnover)越高越好；⑤酶標(biāo)過程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。

　　其中，①②兩點甚為重要，因為并非容易顯示的酶均能形成不可溶性的復(fù)合物。一般認(rèn)為，辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP)較佳，是最常用的一種酶。HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山崳菜)的葉內(nèi)含量最豐富而得名。它是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合組成的一種糖蛋白，糖占16%～18（8條糖鏈分布在HRP分子表面)，分子量40kD，最適pH5～5.5，最適溫度40～45℃； pH4～11，50℃以下均較穩(wěn)定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，最大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值（Od 403/275)衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般認(rèn)為，標(biāo)記酶的RZ值為3.0左右，不應(yīng)小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，例如RZ值為0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高達(dá)75%。對于純度低、質(zhì)量差的酶，需純化后使用。

　　除HRP外，堿性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD)也較常用。ALP分子量約為HRP的2～3倍，最適pH9.0～9.5左右，比較穩(wěn)定，內(nèi)源性ALP也較易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole,分子量240.8kD)抑制，但腸粘膜表面的內(nèi)源性ALP活性不受影響。目前所用的ALP大多系由牛的腸粘膜提取制得，所以腸粘膜等呈強陽性反應(yīng)。

　　ALP最初是由Bulman等用于標(biāo)記抗體的。選用不同的底物，可形成不同顏色的終產(chǎn)物，例如以萘酚（As-Mx)和快藍(lán)（Fast Blue, FB)為底物，生成藍(lán)色沉淀。用快紅（Fast Red, FR)代替FB，形成紅色不溶沉淀。與HRP/4-氯-1-萘酚（CN)或DAB形成的沉淀形成鮮明對比，但FB、FR等沉淀物溶于有機溶劑，不能進(jìn)行脫水、透明等處理。據(jù)報告，利用新品紅（New fuch－sine )顯色，形成的紅色沉淀產(chǎn)物不溶于有機溶劑，不褪色，輕度核復(fù)染后，可制成半永久性保存標(biāo)本。

　　GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍(lán)（P-Nitroblue Tetrazolium),終產(chǎn)物為不溶性的藍(lán)色沉淀，比較穩(wěn)定。從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因為哺乳動物組織內(nèi)不存在內(nèi)源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標(biāo)記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術(shù)。

　�。ǘ�)本科標(biāo)抗體的制備（Boosma,DM, 1983)

　　酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)劑的作用，將酶連結(jié)在抗體分子上。偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個基本特征：①偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結(jié)，必須是不可逆的，即借共價鍵連結(jié)；②偶聯(lián)劑不應(yīng)影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結(jié)合。

　　在HRP標(biāo)記抗體中，常用的偶聯(lián)劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等，現(xiàn)簡介如下。

　　1．戊二 醛標(biāo)記法　　戊二醛為制備各種酶標(biāo)抗體最常用的偶聯(lián)劑。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯釋及戊二醛自身聚合本等雜質(zhì)，故需純化后使用。戊二醛的純度用含雜質(zhì)的二醛的單體戊二醛的OD比值表示，它們的最大吸收光波長分別為235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280)小于3時，制備酶標(biāo)抗體的效果較好，大于3時，需經(jīng)蒸餾或Sephadex G-10柱層析或活性碳吸附等處理，除去雜質(zhì)后應(yīng)用。其制備方法分一步法和兩步法；基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結(jié)合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結(jié)合，將酶連結(jié)于抗體上。

　　（1)一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經(jīng)透析除去標(biāo)記物中剩余的戊二醛，制得酶標(biāo)抗體。優(yōu)點是簡單省時，缺點是反應(yīng)程度不易被控制，因為酶蛋白分子和抗體蛋白分子同戊二醛間的反應(yīng)速率不同，抗體蛋白的氨基數(shù)遠(yuǎn)較HRP為多，與戊二醛反應(yīng)快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內(nèi)和分子間的彼此交聯(lián)，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯(lián)相應(yīng)減少，影響酶的標(biāo)記。據(jù)Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結(jié)，標(biāo)記率較低（約1%～5%)很難獲得理想的酶標(biāo)抗體。

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