一、固定劑
大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對(duì)不同的固定方法或固定劑的反應(yīng)也不盡相同。某些固定劑甚至可同時(shí)破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)（蛋白質(zhì)或肽類)的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來(lái)選擇適宜的固定劑（或固定方法)以及改進(jìn)固定條件。
目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以甲醛類和戊二醛最為常用。在此，簡(jiǎn)要介紹幾種目前較為常用和推薦的固定劑，以供讀者選用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.3)
試劑：多聚甲醛 40g
0.1mol/L磷酸緩沖液 至1000ml
配制方法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡(jiǎn)稱PB)，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌)使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混勻。
該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼續(xù)浸泡固定2～24h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉
試劑：A液：多聚甲醛 40g
蒸餾水 400ml
B液：Na2HPO4·2H2O 16.88g
蒸餾水 300ml
C液：NaOH 3.86g
蒸餾水 200m
配制方法：A液最好在500ml的三角燒瓶中配制（方法同前)，至多聚甲醛完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 將pH調(diào)至7.2～7.4，最后，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>
該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%～1%。該固定劑較溫和，適于組織的長(zhǎng)期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4℃冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液
試劑：飽和苦味酸
40%甲醛 250ml
冰醋酸 50ml
配制方法：先將飽苦味酸過(guò)濾，加入甲醛（有沉淀者禁用)，最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中備用。冰醋酸最好在臨用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。醫(yī).學(xué).全.在.線網(wǎng)站bhskgw.cn
該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑這一，對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整。但因偏酸（pH為3～3.5)，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮較明顯，故不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。此外，操作時(shí)，應(yīng)避免吸入或與皮膚接觸。
4．Zamboni’s(Stefanini’s)液
試劑：多聚甲醛 20g
飽和苦味酸 150ml
Karasson-Schwlt’s PB 至1000ml
配制方法：稱取多聚甲醛20g，加入飽和苦味酸150ml，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌使充分溶解、過(guò)濾、冷卻后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸緩沖液的配制配制方法見(jiàn)后)。
該固定液適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存較純甲醛為優(yōu)，也適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑之一。我們?cè)趹?yīng)用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的飽和苦味酸，以增加其對(duì)組織的穿透力和固定效果，保存更多的組織抗原。固定時(shí)間為6～18h。
5．PLP液 PLP液即過(guò)碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－h(huán)yde fixative)
試劑：過(guò)碘酸鈉
賴氨酸鹽酸鹽（或鹽酸賴氨酸)：
多聚甲醛
蒸餾水
配制方法：
�。�1)貯存液A（0.1mol/L賴氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4)：稱取賴氨酸鹽酸鹽1.827g溶于50ml蒸餾水中，得0.2mol/L的賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，將pH調(diào)至7.4，補(bǔ)足0.1mol/L的PB至100ml，使賴氨酸濃度也為0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好兩周內(nèi)使用。此溶液的滲透濃度為300mOs mmol/L/kg。
�。�2)貯存液B（8%多聚甲醛溶液)：稱8g多聚甲醛加入100ml蒸餾水中，配成8%多聚甲醛液（方法見(jiàn)前)。過(guò)濾后4℃冰箱保存。
�。�3)臨用前，以3份A液與1份B液混合，再加入結(jié)晶過(guò)碘酸鈉（NaIO4)，使NaIO4終濃度為2%。由于AB兩液混合，pH從約7.5降至6.2，故固定時(shí)不需再調(diào)pH值。固定時(shí)間為6～18h。
該固定劑較適于富含糖類的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是借助于過(guò)碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過(guò)賴氨酸的雙價(jià)氨基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。由于組織抗原絕大多數(shù)都是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定劑有選擇性地使糖類固定，這樣既穩(wěn)定了抗原，又不影響其在組織中的位置關(guān)系。Mclean和Nakane等認(rèn)為，最佳的混合是：含0.01mol/L的過(guò)碘酸鹽、0.075mol/L的賴氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸緩沖液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3)
試劑：多聚甲醛 30g
25%戊二醛 80ml
0.1mol/L PB 至1000ml
配制方法：先將多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混勻。
該固定劑適于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，用該固定液在4℃短時(shí)固定，比在較低濃度的戊二醛中長(zhǎng)時(shí)間固定能更好地保存組織的抗原性和細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定時(shí)最好先灌注固定，接著浸泡固定10～30min，用緩沖液漂洗后即可樹(shù)酯包埋或經(jīng)蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 對(duì)苯醌 （Parabenzoquinone)
試劑：對(duì)苯醌 4.0g
0．01mol/L PBS 1 000ml
配制方法：稱取4.0g對(duì)苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
對(duì)苯醌對(duì)抗原具有較好的保護(hù)作用，但對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存有一定影響，故常與醛類固定劑混合使用。一般要求臨用前配制，且避免加熱助溶，因加熱或放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，固定液變?yōu)樽厣梁稚瑫?huì)使組織標(biāo)本背景增加，影響觀察。此外，對(duì)苯醌有劇毒，使用時(shí)避免吸入或與皮膚接觸。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG)
試劑：對(duì)苯醌 20g
多聚甲醛 15g
25%戊二醛 40ml
0.1mol/L二甲酸鈉緩沖液 至1000ml
配制方法：先以500ml左右的二甲酸鈉緩沖液溶解對(duì)苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸鈉緩沖液至1000ml充分混合。
對(duì)苯醌與戊二醛及甲醛聯(lián)合應(yīng)用，即可阻止醛基對(duì)抗原的損害，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，故適于多種類抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)，尤其是免疫電鏡的研究。
9．碳二亞酰胺-戊二醛（ECD-G)液
試劑：0.05mol/L PB 500ml
0.01mol/L PBS 500ml
Tris 約14g
濃HCl 少許
ECD 10g
25%戊二醛 3.5ml
配制方法：先以約500ml的PB與相同體積的PBS混合，加入Tris（使其終濃度為1.4%)溶解，以濃HCl調(diào)pH至7.0，再將事先稱取好的ECD和戊二醛加入混合液，振搖后計(jì)時(shí)，用pH計(jì)檢測(cè)，約2～3min時(shí)，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min內(nèi)調(diào)pH至7.0，此時(shí)，將該混合固定液加入盛有細(xì)胞（經(jīng)PBS漂洗過(guò))的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可進(jìn)一步處理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，簡(jiǎn)稱乙基-CDI，常用于多肽類激素的固定，對(duì)酶等蛋白質(zhì)的固定也有良好效果。ECD單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛、Tris及PB聯(lián)合應(yīng)用，效果明顯改善，細(xì)胞質(zhì)仍可滲透，利用細(xì)胞中抗原的定位，超微結(jié)構(gòu)保存較好。目前認(rèn)為是一種用于培養(yǎng)細(xì)胞電鏡水平免疫細(xì)胞化學(xué)研究的很好的固定劑。
10．四氧化鋨（鋨酸Osmic Acid, OsO4)
配制：將洗凈裝有OsO4的安瓿中加熱后，迅速投入裝有溶劑的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。也可用鉆石刀在安瓿上劃痕，洗凈后再放入瓶中，蓋好瓶塞，用力撞擊安瓿，待其破后加溶劑稀釋。為保證充分溶解，應(yīng)在用前幾天配制。
�。�1)2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。此液常作為儲(chǔ)備液，于冰箱中密封保存。
（2)1% OsO4-PB：
試劑：A、2.26% NaH2PO4·2H2O 4.15ml
B2.52% 8.5ml
C、5.4% 葡萄糖 5ml
D、OsO4 0.5g
配制方法：先分別配好A、B、C三種液體，取A液41.5ml與B液8.5ml混合，將pH調(diào)至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再與5ml C液混合即為0.12mol/L PBG。
�。�3)1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.2～7.4)：
試劑：2% OsO4水溶液 10ml
0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH7.2～7.4) 10ml
配制方法：取2%OsO4儲(chǔ)備液10ml與等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸鈉緩沖液充分混合即可。
OsO4是電鏡研究所必需的試劑，常用于后固定。盡管OsO4主要為脂類固定劑，但也可與肽類及蛋白質(zhì)起作用，形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)。過(guò)氧化物酶的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理后，電子密度增高，適于電鏡研究。但由于OsO4的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)光及電子有較明顯的吸收能力，因此在免疫細(xì)胞化學(xué)染色前常需去除，去鋨在光鏡水平常用1%的高錳酸鉀，在電鏡水平則常用H2O2來(lái)處理。
以上介紹了目前免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的一些固定液。關(guān)于固定液種類還很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等)，這些溶液都能促使蛋白質(zhì)凝固。它們最初只是光學(xué)顯微鏡通用的固定液，但在免疫細(xì)胞化學(xué)上用其它方法不成功時(shí)，也可試用�？傊�，掌握一個(gè)原則，免疫細(xì)胞化學(xué)中，含重金屬的固定液禁用（但Zenker-Formalin可進(jìn)行短時(shí)的固定)。目前多數(shù)認(rèn)為，對(duì)生物標(biāo)本較好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接著在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液中漂洗過(guò)液，這種短時(shí)冷固定處理，有助于超微結(jié)構(gòu)和許多肽類抗原的保存。對(duì)其它較難保存的抗原可嘗試PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。
