第四部分 分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
基因重組可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、溶原性轉(zhuǎn)換等方式進(jìn)行。本部分所選的細(xì)菌耐藥基因的重組實(shí)驗(yàn)屬轉(zhuǎn)化和接合的范疇。
分子診斷技術(shù)是一門新興的生物科學(xué)技術(shù)，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、特異性強(qiáng)，并適用于快速診斷；目前已被廣泛用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。主要方法可分為核酸檢測和蛋白質(zhì)檢測二大類。本部分主要介紹幾種最常用的分子診斷方法。
實(shí)驗(yàn)二十三 細(xì)菌耐藥基因的重組
一、細(xì)菌質(zhì)粒的提取與轉(zhuǎn)化
細(xì)菌的子代具有與親代相同的特征，這由細(xì)菌的遺傳物質(zhì)染色體DNA決定。但有些遺傳特性是由染色體外的遺傳物質(zhì)—質(zhì)粒所編碼的，如抗藥基因即可存在于質(zhì)粒上。這種特性可以通過質(zhì)粒的傳遞，在同種或種屬關(guān)系相近的細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，使細(xì)菌產(chǎn)生廣泛耐藥性。
本實(shí)驗(yàn)以堿裂法提取耐氨芐青霉素供體菌E·coliTG-1 (Amps)的質(zhì)粒DNA，并以冰預(yù)冷CaCl2溶液處理對氨芐青霉素敏感的受體菌JM109，制備感受態(tài)細(xì)胞；在42℃短暫熱休克作用下，可提高接受外源DNA的效率，從而使JM109接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)為耐氨芐青霉素菌。
【材料】
1．菌種：供體菌E·coliTG-1 (含Amps質(zhì)粒)；受體菌JM109株。
2．LB培養(yǎng)基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸出液，10g/LNaCl，960ml雙蒸水；加5M/LNaOH調(diào)PH值至7.0；定容至1L，高壓蒸汽(1.034×105Pa)滅菌20min備用。
3．STE溶液：0.1mol/LNaCl；10mmol/L Tris·HCl；1mmol/LEDTA，pH8.0。
4．溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；50mmol/L Tris·HCL，pH8.0；10mmol/LEDTA，pH8.0；高壓蒸汽滅菌15min，存于4℃。
5．溶液Ⅱ：(臨用時(shí)配)0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/L NaOH儲存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋)；1%SDS。
6．溶液Ⅲ：5mol/L乙酸鉀60ml；冰乙酸11.5ml；雙蒸水28.5ml；配制成100ml量,4℃冷藏備用。
7．酚∶氯仿(1∶1)液、無水乙醇和70%酒精、含RNA酶的TE溶液(pH8.0)、氨芐青霉素(Amp)250mg/ml、0.1mol/LCaCl2等。
【方法】
1．堿裂法提取質(zhì)粒DNA：
(1)將供體菌接種入2～5ml含100μg/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，使細(xì)菌生長繁殖旺盛。
(2)將菌液用移液器移至1.5ml EP管離心，13000rpm離心30s，沉淀菌體。
(3)棄上清，菌體沉淀物加入STE液，使菌體充分懸浮后13000rpm離心30s，吸去培養(yǎng)液,使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。
(4)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ100μl，劇烈振蕩混勻菌液。
(5)加入新配置的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口,快速顛倒EP管5次以混勻內(nèi)容物，使整個EP管內(nèi)壁均接觸有溶液，冰浴5min。
(6)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ 150μl，溫和振蕩約10s以混勻溶液，置冰上3～5min。
(7)13000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新EP管，加入等體積的酚∶氯仿(1∶1)液。
(8)混勻溶液后，13000rpm離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新EP管，加入雙倍體積無水乙醇沉淀雙鏈DNA。振蕩混合，于室溫放置2min。
(9) 13000rpm離心5min，小心吸去上清,倒置EP管于紙巾上,以使所有液體流出，加入1ml70%酒精，4℃洗滌沉淀。
(10)13000 rpm離心5min，盡量棄盡管內(nèi)液體，打開管口室溫干燥10min或37℃溫箱內(nèi)置5～10min以盡量除去殘留液體。
(11)加入30～50μl含RNA酶(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，振蕩后置-20℃冰箱內(nèi)保存。
2．感受態(tài)細(xì)胞的制備：要求無菌操作。
(1)取受體菌JM109接種入5mlLB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜。
(2)取菌液100μl接種至5mlLB培養(yǎng)基中，37℃水浴搖床振搖培養(yǎng)1～2h。
(3)取菌液在波長650nm OD讀數(shù)在0.75左右即可。
(4)取1.5ml置冰預(yù)冷的EP管中，冰浴5min，13000rpm低溫離心30s,沉淀菌體。棄上清，倒置管口約1min。
(5)加入500μl冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，輕輕吹打混勻溶液，置冰上5min，再13000rpm低溫離心30s，收集菌體。
(6)加入150μl冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打混勻，即為感受態(tài)細(xì)菌。冰浴30min后可立即使用，也可置4℃12～24h內(nèi)使用。
3．質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化：
(1)取制備好的上述感受態(tài)細(xì)胞150μl輕輕混勻加供體菌質(zhì)粒DNA10μl，混勻后置冰浴中30min；再42℃熱休克90s；冰浴2min后加入800μlSOC培養(yǎng)基37℃水浴搖床振搖培養(yǎng)1h；再取培養(yǎng)液100μl，移入含Amp的LB瓊脂平板上，用涂布棒涂布均勻，37℃培養(yǎng)過夜，如有轉(zhuǎn)化成功的受體菌，即可以生長。
(2)對照
未經(jīng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的受體菌100μl，接種于含Amp的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，不應(yīng)生長，但接種于不含Amp的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，可以生長。
(3)結(jié)果判斷
因本質(zhì)粒攜帶Amp的耐藥基因，故通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌后，可使原來對Amp敏感的受體菌成為耐藥菌，可在含有Amp的瓊脂平板上生長。
二、細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移－接合
細(xì)菌的耐藥基因既可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方式，在親緣關(guān)系相近的細(xì)菌間轉(zhuǎn)移；也可在親緣相近的細(xì)菌間通過性菌毛的接觸，將耐藥菌(供體菌)的耐藥質(zhì)�；蜣D(zhuǎn)移至不耐藥的細(xì)菌(受體菌)菌體內(nèi)，使受體菌同樣獲得與供體菌相似的耐藥遺傳性狀，這種傳遞遺傳基因的方式，稱為接合。
【材料】
1．菌種：對鏈霉素敏感的福氏痢疾桿菌株、對鏈霉素敏感的大腸桿菌株、對鏈霉素耐藥的大腸桿菌。
2．培養(yǎng)基
(1) 肉湯培養(yǎng)基、肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)基、SS平板、雙糖鐵培養(yǎng)基。
(2) 微量bhskgw.cn/zhicheng/發(fā)酵管：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖5種單糖發(fā)酵管，蛋白胨水、枸櫞酸鹽微量管。
(3) 含100μg/ml鏈霉素SS平板；將配制成的普通SS培養(yǎng)基在燒瓶內(nèi)煮沸，待冷卻至50℃以下時(shí)，加入鏈霉素注射液，使成相應(yīng)濃度，立即搖勻后傾注平板。
3．診斷血清：福氏痢疾桿菌診斷血清。
4．抗生素：鏈霉素每安瓿含粉劑1g，用時(shí)加注射用水稀釋(加4ml注射用水后，每ml含0.25g)。
【方法】
1．將3株細(xì)菌分別接種于SS平板上，37℃培養(yǎng)24h，以證明SS平板適宜于上述3株細(xì)菌的生長。福氏痢疾桿菌不分解乳糖，菌落為無色透明；大腸桿菌分解乳糖，菌落呈粉紅色。在普通SS平板上，3株細(xì)菌均生長良好。
2．將3株細(xì)菌分別接種于含100μg/ml鏈霉素SS平板上。結(jié)果，敏感的福氏痢疾桿菌、敏感的大腸桿菌不生長；耐藥的大腸桿菌能生長，出現(xiàn)粉紅色菌落。
3．正式試驗(yàn)(接合)：將3株細(xì)菌分別移種于肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)12h后，取4份敏感的福氏痢疾桿菌液分別與敏感的大腸桿菌、耐藥的大腸桿菌各1份，分別混合于無菌試管內(nèi)。置37℃，室溫或4℃2~3h后，接種于含100μg/ml鏈霉素的SS平板上，37℃培養(yǎng)18~24h，取出觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在接種敏感的氏福痢疾桿菌與敏感的大腸桿菌混懸液的SS平板上無菌落出現(xiàn)；在接種敏感的福氏痢疾桿菌與耐藥的大腸桿菌混懸液的SS平板上，出現(xiàn)無色透明與粉紅色二種菌落。
4．細(xì)菌鑒定：在含100μg/ml鏈霉素SS國家醫(yī)學(xué)考試網(wǎng)平板上挑選2個無色透明菌落，分別接種雙糖管中。37℃培養(yǎng)24h，雙糖鐵培養(yǎng)基上層仍為紅色，下層轉(zhuǎn)為黃色，無動力。然后取雙糖鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌接種葡、乳、麥、甘、蔗5種單糖微量管，及枸櫞酸鹽、蛋白胨水微量管中，37℃培養(yǎng)24~48h，鑒定其生化特性是否符合福氏痢疾桿菌。再取雙糖鐵培養(yǎng)基中的細(xì)菌，與抗福氏痢疾桿菌診斷血清作玻片凝集試驗(yàn)，觀察是否會發(fā)生特異性凝集反應(yīng)。
通過上述步驟鑒定，可以證明：在含100μg/ml鏈霉素SS平板上新出現(xiàn)的無色透明菌落為獲得了耐藥基因的福氏痢疾桿菌。
