醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-授課講稿:第十七章 支原體

第十七章 支原體和脲原體

　　我們前面已學(xué)習(xí)了細(xì)菌和螺旋體，細(xì)菌和螺旋體都屬于原核細(xì)胞型微生物，另外，我們今天要講的支原體和脲原體、衣原體以及后面要講的立克次體也屬于原核細(xì)胞型微生物。先來學(xué)習(xí)支原體和脲原體。什么是支原體呢？支原體(Mycoplasma)是一類沒有細(xì)胞壁，呈高度多形態(tài)性，能通過0.45um濾菌器,胞膜富含固醇，含DNA與RNA，呈二分裂繁殖的原核細(xì)胞型微生物；支原體是目前所知能在無生命培養(yǎng)基中繁殖的最小微生物。由于它們沒有細(xì)胞壁，能形成有分枝的長絲，故稱之為支原體。

自1898年Nocard首先分離出支原體以來，許多科學(xué)家對這一微生物進(jìn)行了研究，支原體因其沒有細(xì)胞壁故將其歸屬于柔膜體綱（Mollicute)的支原體目(Mycoplasmatales)。支原體目包括3個科：支原體科(Mycoplasmataceae);無膽甾原體科(生長時不需要外源性膽固醇)，螺原體科(生長至一定階段呈螺形)。在支原體科中又可分支原體(Mycoplasma)和脲原體(Ureaplama)2個屬。支原體屬現(xiàn)知有64個種，而脲原體屬僅2個種。其中對人致病的支原體主要為肺炎支原體（M.pneumoniae)、人型支原體(M.hominis)、生殖器支原體(M.genitalium)和穿透支原體(M.penetraus)；而對人致病的脲原體則主要是溶脲脲原體(U.urealyticum)�！　　　　　　�

一、生物學(xué)性狀
　　形態(tài)與結(jié)構(gòu)　　支原體是原核細(xì)胞生物中最小的，大小一般在0.2～0.3μm。沒有細(xì)胞壁，表現(xiàn)為形態(tài)多樣，具有可塑性。支原體用普通染色不易著色，用Giemsa法染色著色很淺。革蘭染色陰性。

最外層是細(xì)胞膜，由蛋白質(zhì)與脂質(zhì)組成的三層結(jié)構(gòu)。內(nèi)、外二層主要是蛋白質(zhì)，中間層為脂質(zhì)。在脂質(zhì)中固醇約占36%。因此凡能作用于固醇的物質(zhì)，如二性霉素B、皂素、毛地黃苷等能引起支原體細(xì)胞膜的破壞而死亡。有的支原體（如肺炎支原體)在細(xì)胞膜外還有一層由多聚糖構(gòu)成的莢膜，有毒性，是支原體的一種致病因素。有的支原體（如肺炎支原體、生殖器支原體和穿透支原體)有一種特殊的頂端結(jié)構(gòu)，能使支原體粘附在宿主上皮細(xì)胞表面。這與支原體在粘膜上的定植和致病有關(guān)。

　　支原體以二分裂繁殖為主，也見以出芽、分枝或由球體延伸成長絲，然后分節(jié)段成為許多球狀或短桿狀的顆粒。支原體和其他原核生物一樣，基因組是一個環(huán)狀雙鏈DNA。分子量較小，只有大腸埃希菌的1/5，故其合成和代謝很有限�！　∨囵B(yǎng)特性：支原體的營養(yǎng)要求比一般細(xì)菌高，需要3－4h才能繁殖一代。除無膽甾原體外，由于支原體的細(xì)胞膜含固醇，所以培養(yǎng)基中必須加入10%～20%人或動物血清。血清主要用于提供固醇和其他長鏈脂肪酸，以供細(xì)胞膜合成需要，且具穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用。
　　支原體一般在pH7.8～8.0間生長，低于7.0則死亡。但溶脲脲原體最適的pH為6.0～6.5，因在培養(yǎng)時溶脲脲原體分解尿素產(chǎn)氨，可使培養(yǎng)基pH升高。當(dāng)培養(yǎng)基指示劑變色即需移種，否則將迅速死亡。支原體生長緩慢，在含1.4%瓊脂的固體培養(yǎng)基上孵育2～3d（有的需要2周)后出現(xiàn)菌落。典型的菌落呈荷包蛋樣，核心較厚，向下長入培養(yǎng)基，周邊為一層薄薄的透明顆粒區(qū)。有的整個菌落呈顆粒狀。肺炎支原體的菌落較大，直徑100～150μm。

溶脲脲原體的菌落最小，僅10～40μm，故曾稱“T”株(tinystrain)。支原體的菌落小，宜在低倍鏡下觀察。在液體培養(yǎng)基中支原體的生長量較少，且個體小，一般不易見到混濁,呈清亮，只有小顆粒沉于管底。支原體是污染細(xì)胞培養(yǎng)的一個重要因素，支原體在細(xì)胞培養(yǎng)中不一定都引起細(xì)胞病變，但可影響這些細(xì)胞用于病毒培養(yǎng)。
　　生化反應(yīng)　　支原體可根據(jù)是否能利用葡萄糖、水解精氨酸和尿素來進(jìn)行鑒別。（表17－1)

抗原結(jié)構(gòu)　支原體細(xì)胞膜上的抗原結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)和糖脂組成。各種支原體均有其特有的抗原結(jié)構(gòu)，交叉反應(yīng)較少，在鑒定支原體時有重要意義。根據(jù)支原體的的糖脂部分可做補體結(jié)合試驗，根據(jù)支原體的蛋白質(zhì)部分可進(jìn)行ELISA試驗。

血清中抗支原體的抗體可用于支原體的鑒定和分型，包括生長抑制試驗(growthinhibitiontest,GIT)和代謝抑制試驗（metabolicinhibitontest,MIT), GIT試驗的操作步驟與藥敏試驗的紙片法相似，將沾有特異性抗血清的紙片貼于接種有支原體的瓊脂平板表面，若血清中的抗體與所接種的支原體相對應(yīng)則紙片周圍生長的菌落受到抑制。MIT試驗是將支原體接種在含有抗血清與酚紅的葡萄糖培養(yǎng)基中，若抗體與支原體相對應(yīng)，則支原體的生成、代謝受到抑制，酚紅不變顏色。這兩種方法的特異性與敏感性均較高。應(yīng)用這二種方法還可將某些支原體分成若干血清型，如溶脲脲原體可分為16型。

抵抗力　支原體因無細(xì)胞壁對理化因素的影響比細(xì)菌敏感，容易被消毒劑滅活，但對醋酸鉈（脲原體除外)、結(jié)晶紫的抵抗力大于細(xì)菌。因此，在分離培養(yǎng)支原體時，培養(yǎng)基中加入一定量醋酸鉈可除去雜菌生長。支原體因沒有細(xì)胞壁，故對干擾細(xì)胞壁合成的抗生素如青霉素、溶菌酶等耐藥，但對干擾蛋白質(zhì)合成的抗生素如強力霉素、氯霉素、紅霉素、螺旋霉素、鏈霉素等敏感。由于國內(nèi)普遍應(yīng)用強力霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星來治療支原體引起的泌尿生殖道感染，許多溶脲脲原體株與人型支原體株對這些藥物已產(chǎn)生了耐藥，但該耐藥株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（如阿奇霉素、交沙霉素等)仍敏感。由于它們大多攜帶耐四環(huán)素基因tetM,故大多對四環(huán)素耐藥。另外，由于支原體的細(xì)胞壁中含有固醇，因此對作用于固醇的藥物（兩性霉素B和皂素)敏感。

二、與細(xì)菌L型的區(qū)別
　　我們知道，細(xì)菌在一些影響細(xì)胞壁合成的抗生素、溶菌酶、抗體和補體的作用下可變成細(xì)胞壁缺陷的L型。細(xì)菌L型與支原體一樣，也缺乏細(xì)胞壁，對同樣缺乏細(xì)胞壁的支原體與細(xì)菌L型有些什么區(qū)別呢？相同點：缺乏細(xì)胞壁，形態(tài)多樣，能通過濾菌器。固體培養(yǎng)基上菌落呈油煎蛋樣或顆粒狀。臨床表現(xiàn)相似，都可引起間質(zhì)性肺炎、泌尿生殖道感染、不育等。

兩者的主要區(qū)別有這么幾點：細(xì)菌L型在脫離誘導(dǎo)因素后�？苫貜�(fù)為原來的細(xì)菌，而支原體則是一種獨立的微生物，在遺傳上與細(xì)菌無關(guān)。另外，支原體的細(xì)胞膜含高濃度固醇（達(dá)36％)，而細(xì)菌L型的細(xì)胞膜不含固醇，因此決定了支原體在培養(yǎng)時需要在培養(yǎng)基中加入膽固醇，而細(xì)菌L型則需要用高滲培養(yǎng)基以維持細(xì)胞的形態(tài)。二者固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)長出的菌落雖然都為油煎蛋樣，但支原體因生長緩慢，其菌落較小，而細(xì)菌L型的菌落稍大( 可達(dá)0.6-1.0mm)；還有，支原體在液體培養(yǎng)基中支原體的生長量較少，且個體小，一般不易見到混濁,呈清亮，只有小顆粒沉于管底,而細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中有一定混濁度，可粘附于管壁或管底，有的呈菌膜生長，有的為沉淀生長等。

三、致病性與免疫性
　　致病性：支原體廣泛存在于人、動物體，大多不致病。對人致病的主要有肺炎支原體，可引起原發(fā)性非典型肺炎。溶脲脲原體、人型支原體和在一定條件下也能引起泌尿生殖系統(tǒng)感染和不育癥。穿透支原體、生殖器支原體和發(fā)酵支原體在艾滋病病人的發(fā)病中起著的輔助因子或促進(jìn)因子的作用，因此被稱之為AIDS相關(guān)支原體。

由支原體所引起的感染大多為表面感染，支原體本身不侵入血液。主要從宿主細(xì)胞胞膜獲取脂質(zhì)和固醇作為養(yǎng)料，引起細(xì)胞損傷；通過產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物（神經(jīng)毒素、酶類)而導(dǎo)致細(xì)胞毒害；另外，溶脲脲原體有尿素酶可水解尿素放出大量氨，對細(xì)胞有毒害，且可促使結(jié)石形成。還能黏附精子，影響其動力；產(chǎn)生神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)，干擾精子與卵子的結(jié)合；與精子膜有共同抗原，造成免疫損傷而致不育。

另外有少數(shù)支原體可引起細(xì)胞內(nèi)感染，如穿透支原體、生殖器支原體和發(fā)酵支原體這些AIDS相關(guān)支原體，可粘附、入侵人類紅細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞，損傷紅細(xì)胞及破壞細(xì)胞免疫，誘發(fā)嚴(yán)重感染與加重艾滋病。。

免疫性：機體感染支原體后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的IgG1和IgG2抗體有調(diào)理作用，可加強巨噬細(xì)胞對支原體的殺傷作用。粘膜局部所產(chǎn)生的SIgA也具有保護(hù)作用。另外，肺炎支原體可作為超抗原，吸引炎癥細(xì)胞浸潤，同時釋放IL-1，IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子。

第二節(jié)　　肺炎支原體

從正常人和動物呼吸道粘膜上可分離出多種支原體，而目前確定的能引起人類呼吸道感染疾病的只有肺炎支原體一種。肺炎支原體除了具有剛才講的支原體的共同特征外，還具有一些自己的一些特性：在細(xì)胞膜外還有一層由多聚糖構(gòu)成的莢膜，具有抗吞噬作用，且有毒性，是支原體的一種致病因素。肺炎支原體有一種特殊的頂端結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)上的黏附因子P1蛋白，能吸附于宿主呼吸道黏膜細(xì)胞受體神經(jīng)氨酸酶上，起定植作用，使其在局部增值，獲取宿主細(xì)胞膜固醇等物質(zhì)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損。支原體肺炎主要經(jīng)飛沫感染。大多發(fā)生于夏末秋初，但一年中任何時間都可發(fā)生。發(fā)病率以5~15歲的青少年最多。支原體肺炎的病理變化以間質(zhì)性肺炎為主，又稱原發(fā)性非典型肺炎(primaryatypicalpneumonia)。肺炎支原體感染后癥狀較輕，僅有發(fā)熱、咳嗽等呼吸道癥狀。近年來一些研究表明，有些喘息性哮喘、支氣管炎與Mp的感染有關(guān)。有時見有呼吸道以外的并發(fā)癥，如心血管癥狀、神經(jīng)癥狀和皮疹。這可能與免疫復(fù)合物的形成和自身抗體的出現(xiàn)有關(guān)。

免疫性：機體感染肺炎支原體后，肺炎支原體為細(xì)胞外寄生，以體液免疫為主，細(xì)胞免疫為輔。在感染早期，肺炎支原體可刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1，IL-6和TNF-α等炎癥性細(xì)胞因子。誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的IgG1和IgG2抗體有調(diào)理作用，促進(jìn)單核細(xì)胞的吞噬及激活補體；粘膜局部所產(chǎn)生的SIgA有阻止肺炎支原體的吸附，也具有保護(hù)作用。另外，肺炎支原體與人類心、肺、腦和腎等組織有共同抗原，可引起II型超敏反應(yīng)（溶血性貧血、心肌炎和腎炎等)；當(dāng)抗原和抗體形成的免疫復(fù)合物則可引起III型超敏反應(yīng)；另外，肺炎支原體還可作為超抗原：激活CD4+T細(xì)胞IL-2,TNF-β，IFN-γ等細(xì)胞因子，以活化巨噬細(xì)胞，加速清除肺炎支原體。

肺炎支原體的診斷方法靠分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢查。肺炎支原體生長緩慢，早期診斷有賴于尋找抗原。

1、分離培養(yǎng)　　取可疑患者的痰或咽拭接種在含有血清和酵母浸膏的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中加入青霉素、醋酸鉈等以便抑制雜菌生長。初次分離時生長緩慢，因此，需要觀察較長時間，且長出的菌落沒有明顯周邊界線。但經(jīng)過多次傳代后生長加快，菌落可成典型荷包蛋樣。這時，可以挑取可疑的菌落經(jīng)生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。分離培養(yǎng)的缺點主要是：與血清學(xué)相比，培養(yǎng)陽性率差，僅為64%。

2.血清學(xué)檢查：包括冷凝集試驗、生長抑制試驗和代謝抑制試驗以及ELISA等。臨床上常用冷凝集試驗進(jìn)行鑒定，即用病人血清與人O型RBC或自身RBC混合，4℃過夜，觀察紅細(xì)胞自身凝集現(xiàn)象，在37℃時其凝集又分散開。但僅50%左右患者出現(xiàn)陽性。必須注意：此反應(yīng)為非特異性，呼吸道合胞病毒感染、腮腺炎、流感等也可出現(xiàn)冷凝集素效價的升高，故只能作為輔助診斷。

生長抑制試驗：應(yīng)用肺炎支原體的特異性抗體浸濕的濾紙片貼在接種可疑菌落的固體培養(yǎng)基上，觀察是否有抑菌環(huán)，如果有，則說明濕肺炎支原體。

代謝抑制試驗：將可疑菌落接種在含有特異性抗體的支原體液體培養(yǎng)基中，如抗體與支原體相對應(yīng)，則與支原體醫(yī).學(xué)全在線結(jié)合，抑制其生長代謝，不會產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，也不會使培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變。

ELISA:包括檢測抗體和檢測抗原。應(yīng)用肺炎支原體蛋白抗原檢測其相應(yīng)的抗體，較敏感，適于早期診斷。但真正的臨床診斷目前傾向于早期檢測抗原，應(yīng)用單克隆抗體通過ELISA試驗（雙抗體夾心法)從患者痰、鼻洗液或支氣管洗液中檢測肺炎支原體分子量42kDa多肽或190kDa的P1蛋白（即黏附素)。

分子生物學(xué)檢測方法：針對肺炎支原體特異性的基因用引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物，通過PCR技術(shù)從患者痰中檢測肺炎支原體DNA，該方法快速、敏感且具有很強的特異性，并可驗證治療效果。有報道經(jīng)紅霉素、氯霉素或螺旋霉素治療2~3周后，患者PCR結(jié)果全部轉(zhuǎn)陰。

肺炎支原體的防治原則：肺炎支原體死疫苗或減毒活疫苗用于免疫預(yù)防效果尚不理想。對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和氯霉素敏感。

第二節(jié)、泌尿生殖道感染支原體

引起泌尿生殖道感染的支原體主要有溶脲脲原體、人型支原體和生殖器支原體。這些支原體在分娩時由母體產(chǎn)道感染新生兒，以后迅速減少；但在成長后從性生活開始又漸增多。故現(xiàn)已被列為性傳播性疾病的病原體。

我國于1986年首次分離出溶脲脲原體，90年代開始受到廣泛重視。在非淋菌性尿道炎（NGU)中，除衣原體外，溶脲脲原體是一種很重要的病原體。1998年有報道3年中2197例性病專科初診為淋病或非淋菌性尿道炎，培養(yǎng)結(jié)果淋球菌占21.4%、衣原體35.9%、溶脲脲原體31.4%。另有報道，201例性病患者中，溶脲脲原體占24.9%,人型支原體占2.0%，溶脲脲原體和衣原體混合感染65.2%。淋病患者中溶脲脲原體檢出率比非淋菌性尿道炎的溶脲脲原體高2倍多，這主要可能是由于淋病奈瑟菌的感染損傷了泌尿生殖道粘膜，因而有利于溶脲脲原體的粘附，也是淋病治愈后有些人仍有癥狀遺留的原因。生殖器支原體與非淋菌性尿道炎有關(guān)。

值得注意的是在正常人的泌尿生殖道中可能有支原體存在，但與NGU患者相比，具有顯著的差異。另外，生殖道的支原體感染對自然流產(chǎn)、出生缺陷、死胎和不孕（育)均有關(guān)系。

溶脲脲原體可引起不孕，國內(nèi)資料證明原因可能是多方面的：吸附于精子表面，阻礙精子的運動;產(chǎn)生神經(jīng)氨酸樣物質(zhì)干擾精子和卵子的結(jié)合;與精子有共同抗原成分，對精子可造成免疫損傷。國內(nèi)報道2181例不育（孕)男女溶脲脲原體檢出率明顯高于正常生育對照組;經(jīng)強力霉素為主的治療后，83.7%轉(zhuǎn)陰，其中恢復(fù)妊娠者占38.7%。

泌尿生殖道支原體的診斷：溶脲脲原體的分離可用加尿素和酚紅的含血清支原體肉湯。肉湯內(nèi)可加青霉素抑制雜菌生長。溶脲脲原體具有尿素酶，可分解尿素產(chǎn)氨，使酚紅變紅，但培養(yǎng)液澄清，表示陽性。在固體培養(yǎng)基上用低倍鏡觀察，可見有微小的荷包蛋樣或顆粒樣菌落生長。

免疫斑點試驗（IDT)是將待檢材料滴加于硝酸纖維濾膜上，干燥后加免疫血清。若兩者特異性相應(yīng)就不能被洗去，可用酶標(biāo)SPA顯色，表示陽性反應(yīng)。此法可用于檢測溶脲脲原體抗原或鑒定培養(yǎng)物。
　　此外尚可應(yīng)用PCR技術(shù)，通過對特異性引物擴增尿素酶基因等來檢測溶脲脲原體。

第三節(jié)、穿透支原體

穿透支原體是1990年首次從1例HIV陽性艾滋病患者尿中分離出的一種新支原體，形態(tài)為桿狀或長燒瓶狀。一端為尖形結(jié)構(gòu)和肺炎支原體相似，具有粘附、穿入細(xì)胞的作用。

穿透支原體生長較慢，培養(yǎng)基中需加血清，菌落呈荷包蛋樣，生化反應(yīng)有別于其他支原體（表17-1)�？乖�和其他支原體不同。對紅霉素、四環(huán)素、林可霉素敏感。
　　穿透支原體的致病性與其尖形結(jié)構(gòu)有關(guān)，具粘附和穿入作用，引起細(xì)胞損傷。感染穿透支原體2h后，即能粘附、穿入人或動物的紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞。12h后支原體在細(xì)胞質(zhì)中大量復(fù)制，導(dǎo)致宿主細(xì)胞受損和死亡。有人研究表明穿透支原體對HIV感染者T細(xì)胞的作用，可能促進(jìn)HIV的復(fù)制和病程的發(fā)展。它對誘導(dǎo)TNF-?的表達(dá)可能也是造成細(xì)胞損傷的主要因素。有人通過ELISA和免疫印跡進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，HIV陽性艾滋病患者234例，穿透支原體陽性的檢出率為4bhskgw.cn/wsj/1.5%,而HIV陽性無艾滋病癥狀者118例，該支原體檢出率僅20.3%;其他性傳播性疾病患者336人此支原體陽性率僅0.8%,而健康HIV陰性者384人陽性率僅0.3%。因而提出穿透支原體感染是艾滋病的輔助致病因素。