第三節(jié) 發(fā)病機制
大量實驗與臨床研究證實，缺血—再灌注損傷的發(fā)生機制與活性氧大量產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣超載、中性粒細胞活化和高能磷酸化合物生成障礙等有關。
一、活性氧的作用
(一)活性氧的基本概念
活性氧(reactiveoxygen)是指化學性質(zhì)活潑的含氧代謝物，包括氧自由基、單線態(tài)氧(1O2)、H202、NO、脂氫過氧化物(LOOH)及其裂解產(chǎn)物LO·和LOO·等(表7—1)。
自由基(freeradical)是指外層軌道上含有單個不配對電子的各種原子、原子團或分子。以氧為中心的自由基稱氧自由基。氧自由基包括：超氧陰離子自由基(O2-)和羥自由基(·OH)。O2-是O2的單電子還原產(chǎn)物，主要來源于線粒體，是體內(nèi)氧自由基存在的主要形式。在Cu2+或Fe2+的作用下，O2-與H2O2反應生成·OH，即O2-+H202→(Fe2+或Cu2+)→O2+·OH+OH-。這就是所謂Fenton反應。 ·OH是體內(nèi)最活躍的氧自由基，對機體危害亦最大。
單線態(tài)氧(1O2)是一種激發(fā)態(tài)氧，其氧分子兩個外層軌道中的一個電子發(fā)生反向自旋改變，使外層軌道兩電子自旋方向相反，氧分子的反應能力大大增加。這種氧分子在紫外光譜中呈現(xiàn)一條單線，故稱為單線態(tài)氧(single oxygen)。單線態(tài)氧是處于不穩(wěn)態(tài)的氧，化學性質(zhì)極其活潑，能迅速氧化許多分子，包括細胞膜上多不飽和脂肪酸，對機體所起的生物學作用與自由基相同。
H202本身不是自由基，但在Cu2+或Fe2+的作用下可生成·OH，或通過均裂生成·OH。這是H202導致氧化應激的主要機制。
NO是L—精氨酸(L—arginine)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOSwww.med126.com)催化下產(chǎn)生的，它有一個不配對電子，故也是一種氣體自由基，它還能與其他自由基反應，生成新的毒性更強的自由基，如過氧亞硝酸根(ONOO-)、過氧亞硝酸(HOONO)和·OH，見下式：
NO+O2- ——(e-+H+)→ONOO- ——H+→HOONO·OH十N02
過氧亞硝酸根氧化性很強，能擴散到鄰近細胞造成細胞損傷；過氧亞硝酸不穩(wěn)定，能釋放出·OH和NO2。
NO作用于基可使與能量代謝、抗氧化和DNA合成有關的酶失活，但這學要較高的濃度，可能由誘導型一氧化氮合酶（iNOS)介導。
脂性自由基為氧自由基與多不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物，包括烷氧自由基（LO·)和烷過氧自由基（LOO·)。
（二)、缺血-再灌注時活性氧增多的機制
許多研究顯示，再灌注數(shù)秒鐘后，組織和血液中的活性氧就可增多加數(shù)倍。在缺血期，組織含氧量減少，作為電子受體的氧不足，活性氧增加不顯著。當再灌注提供氧的同時，也提供了大量電子受體，使氧自由基在短時間內(nèi)爆發(fā)性增多。此外，體內(nèi)清除活性氧的能力不足也是原因之一。
1.線粒體內(nèi)單位電子還原生成氧自由基增加 在生物氧化過程中，O2接受1個電子生成O2-，接受2個電子生成H2O2，接受3個電子生成·OH，接受4個電子生成H2O。其反應如下：
O2—e- → O2-—e-+2H+ →H2O2↓—e-+H+ →·OH—e-+H+ →H2O
H2O
在正常情況下，細胞線粒體內(nèi)的98%的O2在細胞色素氧化酶作用下通過獲得4個電子還原成水，不形成氧自由基，僅1%~2%的O2經(jīng)單電子還原為O2-。據(jù)研究，每天每個線粒體產(chǎn)生的氧自由基可達107個，但很快被體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)所清除。組織細胞缺氧使呼吸鏈傳遞電子的效能下降，不能產(chǎn)生足夠的電子使氧經(jīng)4價還原生成水。而是還原成為生成各種氧自由基。再灌注提供大量的氧，而線粒體呼吸鏈上的酶活性卻不能迅速增強，故線粒體是在灌注時自由基產(chǎn)生的主要來源（如圖7-1)。此外，Ca2+超載使線粒體
功能受損，細胞色素氧化酶系統(tǒng)被抑制，致使氧經(jīng)單電子還原成氧自由基增多；缺氧導致細胞中抗氧化酶活性降低，氧自由基清除減少，也是氧自由基增多的原因之一。
2．血管內(nèi)皮細胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶形成增加 血管內(nèi)皮細胞中富含黃嘌呤酶類。正常時，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)占10％，其前身黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XD)占90％。組織缺血時，由于Ca2+超載，激活Ca2+依賴性蛋白酶使XD轉(zhuǎn)化為XO，使XO大量增加；同時，由于ATP降解，次黃嘌呤生成增加。再灌注提供了大量的氧，使缺血時積聚的次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，后者再在黃嘌呤氧化酶作用下生成尿酸，這兩個過程都有氧自由基生成(圖7—2)。
3．白細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧 白細胞吞噬時伴耗氧量顯著增加的現(xiàn)象，稱呼吸爆發(fā)(respira—toryburst)。其攝取O2的70％～90％經(jīng)細胞內(nèi)的NADPH氧化酶作用形成氧自由基(NADPH+02——NADPH氧化酶→NADP++ H+ + O2-)，用以殺滅病原微生物。組織缺血過程中大量中性粒細胞被激活，再灌注又提供大量氧，從而使活性氧大量增加。
4．兒茶酚胺的自身氧化 再灌注也是一種應激狀態(tài)，此時交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)會釋放和分泌大量兒茶酚胺，后者自氧化生成O2- 。
5．誘導型NOS表達增強 單核細胞和中性粒細胞中含有iNOS。缺血再灌注導致白細胞活化后，iNOS表達上調(diào)，導致NO大量生成。NO及其代謝產(chǎn)物OONO-、HOONO和·OH都可導致組織損傷。
6．體內(nèi)清除活性氧的能力下降 生物體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng)，包括：
(1)抗氧化酶類 如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)清除O2-，過氧化氫酶(catalase，CAT)清除H2O2，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHpx)清除H2O2，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶清除脂性自由基等。
(2)非酶性抗氧化物 如維生素E、谷胱甘肽、清蛋白、銅藍蛋白等也可清除活性氧或控制活性氧的生成。
正常情況下活性氧不斷產(chǎn)生，又不斷被清除。活性氧的作用具有兩重性，一定濃度的活性氧參與生命活動中的許多化學反應、信號轉(zhuǎn)導及基因調(diào)控；缺血—再灌注時，由于清除活性氧的能力下降及活性氧大量產(chǎn)生，則造成組織細胞嚴重損傷。
(三)活性氧的損傷作用
活性氧能和膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等多種細胞成分發(fā)生反應，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成細胞損傷。
l.膜脂質(zhì)過氧化 生物膜(細胞膜、線粒體膜、溶酶體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)是活性氧攻擊的主要部位。生物膜的主要成分是極性脂質(zhì)(磷脂、膽固醇)和膜蛋白(酶、受體、離子通道等)。膜磷脂富含多價不飽和脂肪酸，易發(fā)生脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化的直接后果是其不飽和性改變，繼之發(fā)生膜流動性降低、脆性增加、膜受體和酶功能改變。嚴重醫(yī)學全.在線者可導致細胞結(jié)構(gòu)破壞，細胞內(nèi)容物外溢，細胞死亡。影響大小因膜本身的位置和功能而異。
(1)細胞膜結(jié)構(gòu)破壞 細胞膜脂質(zhì)過氧化使細胞膜受體失活、離子通道變構(gòu)、酶活性改變，從而引起細胞功能和結(jié)構(gòu)變化(圖7—3)。
(2)細胞器膜結(jié)構(gòu)破壞 活性氧對細胞器膜脂質(zhì)攻擊結(jié)果是：①溶酶體破裂釋放溶酶體酶，引起細胞結(jié)構(gòu)損壞；②線粒體腫脹、功能障礙，產(chǎn)能減少；③肌漿網(wǎng)Ca2+—ATP酶活性降低使攝取的Ca2+減少，導致細胞內(nèi)鈣超載。
(3)脂質(zhì)信號分子生成異常 磷脂是細胞膜所特有的成分，其中肌醇磷脂在信號轉(zhuǎn)導過程中十分重要。雖然肌醇磷脂的脂質(zhì)過氧化不會影響膜的穩(wěn)定性，但卻會使前列腺素(PGs)、1，4，5—三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)等生成障礙，致使細胞信號轉(zhuǎn)導異常。
2.蛋白質(zhì)失活 活性氧可以使蛋白質(zhì)分子氧化而發(fā)生變性、聚合、降解或肽鏈斷裂，從而使酶、受體、離子通道等產(chǎn)生功能障礙�；钚匝醯墓裟繕税ǖ鞍踪|(zhì)肽鏈中的蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等殘基，嚴重影響蛋白質(zhì)功能。活性氧對酶活性的影響包括：①破壞氧化酶的活性中心——巰基；②破壞酶活性所必需的脂質(zhì)微環(huán)境；③在酶蛋白之間發(fā)生交聯(lián)形成多聚物；④攻擊酶活性中心部位的氨基酸；⑤也可激活一些酶，如激活磷脂酶A2使膜磷脂釋放出花生四烯酸，導致前列腺素、白三烯生成增多，炎癥反應加劇。
3．DNA損傷 活性氧對核酸的作用主要是堿基修飾、斷裂和交聯(lián)。造成DNA損傷的活性氧主要為·OH和NO。DNA損傷包括：
(1)細胞核DNA損傷 細胞核DNA是生物體遺傳信息的攜帶者，具有編碼蛋白質(zhì)的功能，決定著生物體的主要生命活動。顯然，DNA損傷的危害是十分嚴重的。其主要損傷表現(xiàn)為：①堿基修飾：活性氧與堿基發(fā)生加成反應，如·OH在胸腺嘧啶的5，6—雙鍵上進行加成反應，形成胸腺嘧啶自由基，從而改變了DNA的結(jié)構(gòu)，影響遺傳信息的正確表達；②DNA斷裂：·OH和NO從核酸的戊糖中奪取氫原子，使其形成在C4上具有未配對電子的自由基，然后在β—位發(fā)生鏈的斷裂，使核酸分子的完整性被破壞，導致遺傳突變；③DNA交聯(lián)：活性氧可使DNA—DNA、DNA—組蛋白之間形成共價結(jié)合，引起交聯(lián)。在雙股DNA鏈之間形成股間交聯(lián)，從而限制股間解鏈，導致DNA復制、轉(zhuǎn)錄障礙，使遺傳信息表達受阻。 ·
(2)線粒體DNA損傷 線粒體不僅是體內(nèi)能源生產(chǎn)基地，同時還有自己的遺傳系統(tǒng)，線粒體DNA(mtDNA)編碼線粒體tRNA、rRNA及一些線粒體蛋白質(zhì)，如電子傳遞鏈酶復合體中的亞基等。線粒體DNA是裸露的，不與組蛋白結(jié)合，缺乏修復機制，且代謝轉(zhuǎn)換率高，因而極易受到自由基攻擊。線粒體DNA受損可導致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙。此外，線粒體與細胞凋亡關系密切。O2-和ON00-能導致線粒體膜通透性增加，線粒體膜孔道開放，細胞色素C和其他凋亡因子溢出，進而活化凋亡蛋白酶(caspase)，誘導細胞凋亡。
4．細胞間基質(zhì)破壞 氧自由基可使透明質(zhì)酸酶降解、膠原蛋白交聯(lián)，從而使細胞間基質(zhì)變得疏松、彈性降低。
