1.2 研究方法
1.2.1 外周血白細(xì)胞的分離
提取病例組及對(duì)照組肘靜脈新鮮全血15ml,立即用EDTA抗凝。離心棄去血漿后再加淋巴分離液,移液器收集界面上的白細(xì)胞層,離心棄上清可見(jiàn)白色的沉淀,加入Trizol試劑,用移液器充分抽打、混勻,直到形成清亮不粘稠的液體。
1.2.2細(xì)胞總RNA的抽提與鑒定
Trizol法抽提細(xì)胞總RNA,樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A230、A260、A280值,甲醛變性膠電泳檢測(cè)28S、18S條帶變化,鑒定樣品質(zhì)量是否符合表達(dá)譜芯片的實(shí)驗(yàn)要求。
1.2.3對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記
雙鏈cDNA的合成與純化,以cDNA為模板用隨機(jī)引物和Klenow酶進(jìn)行DNA鏈的標(biāo)記,并在DNA鏈延伸過(guò)程中摻入熒光素。
1.2.4雜交與清洗
將標(biāo)記的DNA溶于雜交液中42℃雜交過(guò)夜,清洗后玻片甩干即可用于掃描。
1.2.5信號(hào)掃描和分析
芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描,分別得到子癇前期外周血cDNA的Cy5圖像文件和正常妊娠外周血的Cy3圖像文件。采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值,對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化;最后以差異為兩倍的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。比值>2.0表示子癇前期外周血基因表達(dá)水平高于正常妊娠,比值<0.5則顯示子癇前期外周血基因表達(dá)水平低于正常妊娠。
2結(jié)果
2.1總RNA抽提與鑒定結(jié)果醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站bhskgw.cn
樣本的總RNA經(jīng)紫外分光A230、A260、A280測(cè)定,甲醛變性膠電泳檢驗(yàn)RNA樣品質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。OD260/OD280值為1.714~1.965,均介于1.7~2.1之間。結(jié)果顯示總RNA無(wú)降解,28S、18S條帶清晰,28S比18S的亮度接近2∶1,提示得到高純化的總RNA。
2.2基因表達(dá)譜芯片雜交結(jié)果
圖1和圖2均為Cy5熒光標(biāo)記的子癇前期外周血白細(xì)胞cDNA雜交掃描圖像與Cy3熒光標(biāo)記的正常妊娠外周血白細(xì)胞cDNA雜交掃描圖像的疊加圖像。在圖像中,如果Cy3信號(hào)較強(qiáng),該點(diǎn)呈綠色,表示該基因呈下調(diào)趨勢(shì);如果Cy5信號(hào)較強(qiáng),該點(diǎn)呈紅色,表示該基因呈上調(diào)趨勢(shì)。在兩種外周血中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)娘@黃色,而均不表達(dá)的則為無(wú)色。圖1顯示腫瘤壞死因子(TNF-α)在子癇前期外周血表達(dá)增高,Cy5信號(hào)較強(qiáng),呈紅色。圖2顯示白介素-4受體(IL4R)在子癇前期外周血表達(dá)降低,Cy3信號(hào)較強(qiáng),呈綠色。