體外培育牛黃—膽紅素的測(cè)定—紫外可見(jiàn)分光光度法

本方法采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定體外培育牛黃中膽紅素的含量。

本方法適用于牛科動(dòng)物牛Bos Taurus domesticus Gmelin的新鮮膽汁作母液，加入去氧膽酸、膽酸、復(fù)合膽紅素鈣等制成的體外培育牛黃的測(cè)定

供試品經(jīng)三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液加熱回流，提取液加入乙醇和重氮化溶液，暗處放置后，置于分光光度計(jì)，于波長(zhǎng)533nm處測(cè)定吸收度，按膽紅素計(jì)算其含量。

1. 三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液

2 .乙醇

3 .重氮化溶液

4 .鹽酸

1. 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

2. 分液漏斗

1. 對(duì)照品溶液的制備

去膽紅素對(duì)照品10mg，精密稱(chēng)定，置100 mL棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL含膽紅素10μg的溶液。

2. 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉10mg，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加三氯甲烷-乙醇（7：3)的混合溶液60 mL、鹽酸1滴，搖勻，置水浴上加熱回流30分鐘，放冷，移至100 mL棕色量瓶中。容器用少量混合溶液洗滌，洗液并入同一量瓶中，加上述混合溶液至刻度，搖勻。精密量取3 mL，置具塞試管中，加乙醇至9 mL，精密加入重氮化溶液（甲液：取對(duì)氨基苯磺酸0.1g，加鹽酸1.5 mL與水適量使成100 mL。乙液：取亞硝酸鈉0.5g，用水溶解并稀釋至100 mL，置冰箱內(nèi)保存。臨用時(shí)取甲液10 mL與乙液0.3 mL，混勻)1 mL，搖勻，在15~20℃的暗處放置1小時(shí)，作為供試品溶液。

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液1mL、2mL、3mL、4 mL、5 mL，分別置具塞試管中，加乙醇至9 mL，各精密加入重氮化溶液（甲液：取對(duì)氨基苯磺酸0.1g，加鹽酸1.5 mL與水適量使成100 mL。乙液：取亞硝酸鈉0.5g，用水溶解并稀釋至100 mL，置冰箱內(nèi)保存。臨用時(shí)取甲液10 mL與乙液0.3 mL，混勻)1 mL，搖勻，在15~20℃的暗處放置1小時(shí)，以相應(yīng)的試劑為空白，在533nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 供試品的測(cè)定

精密量取上述供試品溶液3mL，置具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定項(xiàng)下的方法，自“加乙醇至9 mL”起，依法測(cè)定吸收度。

注：分光光度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對(duì)照，采用1cm的石英吸收池。以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在０.３－０.７之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計(jì)算含量。