動(dòng)脈粥樣硬化:第二節(jié)　轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

在研究心血管疾病時(shí)，主要運(yùn)用顯微注射法、基因打靶或基因剔除等方法制備各種TGM模型。

1．顯微注射法

Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV₄₀DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序的TGM。1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級(jí)巨鼠”（supermouse)曾引起整個(gè)生物學(xué)界的轟動(dòng)。這一方法外源DNA整合率高、容量大，DNA長(zhǎng)到50kb仍然有效，實(shí)驗(yàn)周期縮短，因而應(yīng)用較廣泛，是制備TGM的一種常用方法。

這一方法的實(shí)驗(yàn)程序如下：⑴準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母)：將可育雌鼠與輸精管結(jié)扎后絕育的雄鼠交配，剌激雌鼠發(fā)生一系列妊娠變化而得到假孕母鼠作為受精卵轉(zhuǎn)基因后的養(yǎng)母；⑵受精卵的準(zhǔn)備：可育雌鼠注射孕馬血清與絨毛膜促性腺激素（HCG)促使超排卵。處理后與可育雄鼠交配。次日從輸卵管內(nèi)收集受精卵備用；⑶基因?qū)�入：用顯微注射裝置將目的基因溶液導(dǎo)入受精卵雄性原核內(nèi)；⑷胚胎移植：將已轉(zhuǎn)入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，使胚胎在養(yǎng)母體內(nèi)發(fā)育成熟；⑸對(duì)幼鼠的鑒定：①幼鼠發(fā)生斷乳后自尾部提取DNA，與目的基因探針作分子雜交，鑒定外源基因是否整合，有整合的鼠稱為首建鼠（founder)；②建立鼠系，將帶有外源基因的小鼠與未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的小鼠交配、傳代后，后代有50%機(jī)率帶有整合的基因供實(shí)驗(yàn)用。也可將合適的組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)建立細(xì)胞系；③自小鼠內(nèi)臟提取RNA，與目的基因探針做分子雜交，比鑒定外源基因的表達(dá)和表達(dá)的組織特異性。表達(dá)產(chǎn)物可以測(cè)定活性的，也可直接自血液或組織測(cè)定活性蛋白質(zhì)，常用的方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)或放射免疫測(cè)定（RIA)等。亦可取胚胎進(jìn)行分析。顯微注射法簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程如圖23-2所示。我國(guó)已有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室（如中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)應(yīng)用此法進(jìn)行載脂蛋白TGM研究。

圖23-2 顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的程序

2．基因打靶與基因剔除技術(shù)

ES細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)胚團(tuán)（inner,cell mass)中分離出來(lái)的。它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。這種細(xì)胞有兩個(gè)特點(diǎn)，一是它本身可以分裂、增殖，形成細(xì)胞集落；另一特點(diǎn)是經(jīng)過(guò)發(fā)育可以形成正常的動(dòng)物后代。因此，借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無(wú)功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。正是由于ES細(xì)胞的研究成功與廣泛應(yīng)用，才使得基因打靶與基因剔除技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用成為可能而且近來(lái)取得長(zhǎng)足發(fā)展。

基因打靶是指外源DNA片段上帶有與受體細(xì)胞染色體相應(yīng)部位的同源序列，導(dǎo)入ES細(xì)胞后在同源部位發(fā)生定點(diǎn)整合，這種整合是通過(guò)同源重組的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Piedrahita等（1992)應(yīng)用此技術(shù)已成功地篩選出攜帶突變ApoE基因雜交鼠后代。該方法的一般策略如下：

如果外源DNA含有突變失活的基因，定點(diǎn)整合人ES細(xì)胞染色體后取代原來(lái)的同源序列，即是基因剔除。將這樣的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。多采用突變基因（mutated gene)剔除正�；�因以產(chǎn)生定位突變（target mutation)。即首先選定需要突變基因的全部或部分DNA序列，通過(guò)插入、修飾、刪除或置換等手段落使其突變，成為靶載體，將靶載體導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞中，使之與細(xì)胞染色體內(nèi)同源的靶序列進(jìn)行重組，達(dá)到定位突變細(xì)胞內(nèi)該基因的目的。然后在細(xì)胞水平和分子水平篩選富集發(fā)生突變細(xì)胞，并注射到小鼠囊胚腔內(nèi)，將這些囊胚導(dǎo)入假孕母鼠子宮中，所產(chǎn)生的子代雄性嵌合鼠與正常雌鼠交配可獲得生殖系攜帶該突變基因的純合鼠。最后對(duì)純合鼠的表型、基因型、基因表達(dá)及其產(chǎn)生等進(jìn)行分析。

目前篩選真正發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞的方案有數(shù)種，如正負(fù)雙向選擇法（positive and negativeselection,PNS)、標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法及PCR法，其中用得最多的方法首推PNS法。其基本原理是：構(gòu)建含有一段與靶基因同源序列（10～15kb)的載體，該序列的一個(gè)外顯子插有neo^r基因作為正選擇的標(biāo)志，在此序列3’端插有不含啟動(dòng)子的皰疹病毒胸苷激酶（HSV-tk)基因作為負(fù)選擇，HSV-tk基因由bhskgw.cn/wszg/鄰近的neo^r基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。用電轉(zhuǎn)移（electroporation)法將重組體導(dǎo)入ES細(xì)胞，繼續(xù)作體外培養(yǎng)，并以新霉素（G418)和致死核苷類似物（GANC)作雙重篩選。因隨機(jī)插入的DNA通常以從頭至尾整合入受體細(xì)胞DNA中，HSV-tk⁺基因產(chǎn)物可使GANC轉(zhuǎn)變成一種有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡。如果發(fā)生同源重組，由于tk基因在同源區(qū)之外不能整合，neo^r基因在同源區(qū)之內(nèi)得以保留，這樣受體細(xì)胞抗G418有正選擇作用，對(duì)GANC無(wú)轉(zhuǎn)變功能而有負(fù)選擇作用，因此認(rèn)為存活的細(xì)胞是與導(dǎo)入基因發(fā)生同源重組的（圖23-3)。Plump等（1992)用基因剔除技術(shù)已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用這一AS小鼠模型研究了飲食和遺傳因素對(duì)AS的影響。

圖 23-3 正負(fù)雙向選擇法示意圖

a：同源重組；b：隨機(jī)整合；neo^r：新霉素抗性基因；HSV-tkc：皰

疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：干細(xì)胞內(nèi)源基因（與導(dǎo)入基因同源)；

G418：新霉素；GANC：抗致死的核苷類似物GANC；GANC：核苷類似

物參與合成，細(xì)胞致死。

近幾來(lái)，隨著對(duì)基因失活方面研究的深入，引發(fā)了基因剔除技術(shù)的一大飛躍，產(chǎn)生了條件性基因剔除（conditional gene knockout)。條件性基因剔除是指某一特定細(xì)胞類型或細(xì)胞發(fā)育的特定階段剔除某一特定基因的技術(shù)。目前多采用Cre-loxP重組系統(tǒng)（Cre-loxP-mediated genereplacement ,Cre-loxP recombination system)。其中Cre重組酶來(lái)源于侵染大腸桿菌P₁噬菌體。分子量38000，無(wú)論在大腸桿菌體內(nèi)或體外，它都能啟動(dòng)DNA分子間或分子內(nèi)的聯(lián)合與重組，重組發(fā)生在一個(gè)被稱為loxP的www.med126.com特異位點(diǎn)（loxp site)，且不需要其他的蛋白質(zhì)因子。在Cre酶存在時(shí)，兩個(gè)loxP位點(diǎn)可以同源重組，切除其中間的部分，留下一個(gè)loxP位點(diǎn)。其原理如圖23-4所示。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Cre重組酶也同樣能引起DNA聯(lián)合和位點(diǎn)特異性重組。

圖23-4 Cre酶作用原理

1Cre基因轉(zhuǎn)譯成Cre酶；2Cre酶作用于基因組上loxP位點(diǎn)；3Cre酶使兩個(gè)loxP位點(diǎn)聯(lián)合；4兩個(gè)loxP位點(diǎn)發(fā)生同源重組切除X基因及一個(gè)loxP位點(diǎn)而僅留下一個(gè)loxP位點(diǎn)。

Cu等（1994)在鼠的ES細(xì)胞中利用Cre-loxP重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除的程序如下：①用常規(guī)性基因剔除方法將一段新構(gòu)建的DNA序列整合至內(nèi)源基因組，這段新構(gòu)建的DNA序列由新的（突變的)基因片段，選擇性標(biāo)記基因HSV-tk及neo^r、一個(gè)將被取代的正常基因片段等幾部分組成。在此新構(gòu)建的NDA序列中，在可選擇性標(biāo)記基因和正�；�因片段的兩側(cè)都連有l(wèi)oxP位點(diǎn)；②經(jīng)過(guò)基因剔除的ES細(xì)胞被一個(gè)編碼Cre重組酶載體迅速傳染，因此處于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的HSV-tk、neo^r及正常的野生型基因均在Cre酶的作用下而被切除，只在原來(lái)的位置上留下了突變的基因和其3’端帶有一個(gè)loxP位點(diǎn)，其Cre-loxP重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除程序如圖23-5所示。

條件性基因剔除系統(tǒng)的建立，使得轉(zhuǎn)基因的目的更加明確，效果也進(jìn)一步精確可靠，是基因剔除方法上的一個(gè)重大突破，將給動(dòng)脈粥樣硬化的研究增加更便利的條件。

圖23-5 CreloxP重組系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因剔除程序

1有待于被剔除的基因組上某野生型基因片段；2將一個(gè)loxP位點(diǎn)插在野生型基因片段的3’端；3將新構(gòu)建的DNA序列整合到基因組上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、neo^r野生型基因及一個(gè)loxP位點(diǎn)；5經(jīng)過(guò)Cre-loxP重組系統(tǒng)作用后所形成的DNA序列。