臨床生物化學(xué):第三節(jié)　臨床生化方法學(xué)的評價

一、評價實驗與分析誤差類型的關(guān)系

方法學(xué)評價（evalution of methodology)的基本內(nèi)容是通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度與準(zhǔn)確度，在實驗中測定的是不精密度與不準(zhǔn)確度，不倫精密度還是準(zhǔn)確度，強調(diào)的都是誤差，評價實驗的過程就是對誤差的測定。因此，方法評價的各項實驗是配合檢測各種類型的分析誤差而設(shè)計的，表20-1表示了它們之間的關(guān)系。

表20-1　評價實驗與分析誤差類型的關(guān)系

二、實驗方法的評價

（一)重復(fù)性試驗

目的在于考察候選方法的隨機誤差，重復(fù)性試驗的方法是對同一材料分成數(shù)份試驗樣品，進行多次分析測定。

⒈試驗形式與方法 ①批內(nèi)重復(fù)性試驗：可以用同一份標(biāo)本在相當(dāng)短的時間內(nèi)，按規(guī)定的操作方法，在較穩(wěn)定的條件下，作多次（一般為20次)重復(fù)性測定。計算其X、S與CV。不同性質(zhì)的分析對CV值的要求不同，一般應(yīng)小于5％，精密的分析或多次平行測定，要求小于2％。②天內(nèi)重復(fù)性試驗：在一天內(nèi)對一個或數(shù)個標(biāo)本作數(shù)批重復(fù)測定，其它條件和批內(nèi)相同，但因在一天內(nèi)重復(fù)測定幾批，所受影響因素要比批內(nèi)多，所得的CV值可能比批內(nèi)大一些。③天間重復(fù)性試驗：將同一標(biāo)bhskgw.cn/sanji/本每天一次隨機插入常規(guī)標(biāo)本中測定，連續(xù)20個工作日，這樣得到的CV值比上述批內(nèi)與天內(nèi)大，能反映實際工作的情況。④病人標(biāo)本的平行雙份測定：如不易得到含有合適基質(zhì)的穩(wěn)定樣品（如作血液pH的重復(fù)性測定的標(biāo)本)，可采用病人標(biāo)本的雙份測定來代替重復(fù)性試驗，選擇一批病人標(biāo)本（20至100份)，待測物濃度應(yīng)在實驗方法的分析范圍內(nèi)，有高有低；記錄標(biāo)本的特性，如有某種藥物、混濁、溶血或有尿毒癥等，可影響其準(zhǔn)確性�？勺饕慌�或幾批分析，但每一標(biāo)本都平行做兩份，用雙份分析結(jié)果之差（d)來計算S（∑d/2N)作為不精密度的指標(biāo)。

⒉分析樣品的選擇作重復(fù)性試驗的樣品，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液、控制物溶液、病人標(biāo)本或混合血清均可，視其用途而定。作批內(nèi)重復(fù)性試驗，用標(biāo)準(zhǔn)液可以得到各種不同濃度，較簡便，它代表了最好的重復(fù)性性能。若結(jié)果良好，說明方法操作是適宜的，再進一步用其它樣品進行測定。在進行天間重復(fù)性試驗時，用凍干質(zhì)控血清較好，因其穩(wěn)定、方便。其它樣品進行測定。在進行天間重復(fù)性試驗時，用凍干質(zhì)控血清較好，因其穩(wěn)定、方便。

⒊分析物濃度的選擇進行重復(fù)性試驗時被測物濃度，宜選擇在醫(yī)學(xué)上具有決定性意義的濃度進行試驗，因為這種濃度在臨床bhskgw.cn/zhicheng/分析實驗結(jié)果時最有用處。

（二)回收試驗

所謂回收即分析方法正確測定加入常規(guī)分析樣品中的純分析物的能力。目的是測定比例系統(tǒng)誤差，以衡量候選方法的準(zhǔn)確度。

⒈方法將被分析的純品標(biāo)準(zhǔn)液加入病人樣品中，成為分析樣品，原病人樣品加入相同量的無分析物的溶液作基礎(chǔ)樣品，然后用實驗方法分析，兩者測定結(jié)果的差值為回收量。

⒉回收率計算 以測定血清鈣為例說明如下：

⑴樣品制備

1)基礎(chǔ)樣品：血清2ml＋蒸餾水0.1ml；

2)分析樣品：血清2ml＋4mmol/L鈣標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml；

3)分析樣品：血清2ml＋25mmol/L鈣標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml；

⑵計算公式及計算結(jié)果

故本例的②③管的加入量分別為：

回收濃度＝分析樣品測得濃度－基礎(chǔ)樣品測得濃度

回收率（％)＝回收濃度/加入濃度×100％

本例結(jié)果見表20-2

表20-2　血清鈣回收試驗結(jié)果

理想的結(jié)果期望回收率達到100％，現(xiàn)在平均回收率為95.7％，有4.3％的比例誤差，它表明一個含鈣真值為2.5mmol/L的標(biāo)本，若用該方法測定，約為2.39mmol/L（2.5×95.79％)，誤差為0.11mmol/L（2.5×4.3％)。

⒊注意事項

①準(zhǔn)確吸量，因為被分析物的理論值是根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)液體積及原樣品的體積計算所得，吸量稍有不準(zhǔn)，就會影響結(jié)果。因此，選擇經(jīng)過校準(zhǔn)的吸管，嚴(yán)格地清洗與干燥，以及按正規(guī)要求吸量均很重要。②樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)液后，總的濃度必須在測定方法的分析范圍內(nèi)，一般須作加入高、中、低不同濃度的回收試驗，計算平均回收率。③加入標(biāo)準(zhǔn)液后，最好使實驗樣品中被測濃度達到醫(yī)學(xué)上具有決定意義的濃度。④加入標(biāo)準(zhǔn)液的體積在整個樣品中要少，一般在10％以內(nèi)。若稀釋過大，誤差將發(fā)生改變，甚至消失。

（三)干擾試驗

干擾試驗的目的也是用來衡量候選方法的準(zhǔn)確度的。在加入一定濃度的干擾物的條件下，形成的是恒定系統(tǒng)誤差。干擾物濃度不同，誤差大小也不同。

⒈方法基本與回收試驗一樣，但是加入的是疑有干擾或非特異性反應(yīng)的物質(zhì)而不是標(biāo)準(zhǔn)液。以肌酐對葡萄糖測定的干擾試驗方法及結(jié)果簡述如下：

樣品制備

1)基礎(chǔ)樣品：0.9ml血清＋0.1ml蒸餾水。

2)分析樣品：0.9ml血清＋0.1ml 442μmol/L肌酐溶液。

3) 分析樣品：0.9ml血清＋0.1ml 884μmol/L肌酐溶液。

所有各樣品均作雙份葡萄糖測定取平均值。加入值的計算同回收試驗。分析樣品與基礎(chǔ)樣品兩值之差為干擾值。結(jié)果如下：

結(jié)果說明：每88.4μmol/L肌酐約使葡萄糖測定增加0.056mmol/L。在正常人，肌酐約為132μmol/L，將使葡萄糖測定帶入約0.11mmol/L的誤差，在臨床上并無意義。但肌酐病理值可達884-1786μmol/L，對葡萄糖測定引入約0.56-1.11mmol/L誤差，就會影響臨床應(yīng)用。

⒉可疑干擾物的濃度加入可疑干擾物的濃度須達到有價值的范圍，有可能應(yīng)達到病理標(biāo)本的最高濃度值，在確證有影響后應(yīng)測定在何濃度時，產(chǎn)生的誤差在臨床上無意義，即確定使分析結(jié)果影響臨床應(yīng)用價值的最低可疑物濃度值。

⒊被試驗的物質(zhì)可根據(jù)該方法的反應(yīng)原理，提示出可能的干擾物。一般應(yīng)考慮的是用膽紅素、溶血（血紅蛋白)、脂血、防腐劑、抗凝劑等進行試驗。但干擾試驗有一定的局限性，因為人們只能試驗?zāi)承┪镔|(zhì)的影響，還有許多藥物和食物成分未經(jīng)試驗，亦不能認為無關(guān)。干擾試驗也可用比較方法進行，比較方法若為常規(guī)方法更應(yīng)如此，若兩個方法具有相同干擾，這種干擾不應(yīng)作為否定試驗方法的理由，試驗方法應(yīng)在其它性能方面較原常規(guī)方法為好，從而對檢驗質(zhì)量有所提高。

⒋消除干擾的常用方法 ①作空白（對照)試驗。一是試劑空白，可以校正標(biāo)本讀數(shù)中的試劑部分；另一種是標(biāo)本空白，用以補償標(biāo)本中被測物以外的其它物質(zhì)的影響。②采用各種物理、化學(xué)的方法、分離除去干擾物。③近年來出現(xiàn)的由計算機控制的雙波長或多波長檢測儀器，在排除干擾因素方面既有效又簡便（詳見儀器分析有關(guān)內(nèi)容)。

（四)方法比較實驗

對比試驗用于檢測候選方法的系統(tǒng)分析誤差，包括比例和恒定兩種系統(tǒng)誤差在內(nèi)。如果對適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)進行分析，也可提供系統(tǒng)誤差的性質(zhì)究竟是屬恒定誤差還是比例誤差。

⒈方法對一組病人的標(biāo)本用候選方法和對比方法同時進行分析測定，最后觀察兩者之間的差異。這是考驗候選方法是否可被采用的重要措施。

⒉比較方法的選擇在臨床生化常規(guī)方法評價時，最好選擇參考方法作為對比方法。這樣在解釋結(jié)果時，就可把方法間的任何分析誤差都可歸于候選方法。

⒊注意事項 ①試驗樣品數(shù)：一般作40-100例，包括各種疾病的樣品，即包括在常規(guī)工作中可能遇到的整個分析范圍。選擇合適的樣品比增加試驗樣品的數(shù)目更為重要。②重復(fù)分析：一般每個樣品用兩種方法各測定一次，最好各測定兩次，不是平行測定，而是分兩批進行。兩種方法及兩批測定，須在同一天內(nèi)，最好是在4小時內(nèi)進行。③時間間隔：每天測定2-5個樣品，約測定20天。④結(jié)果的圖示：根據(jù)實驗結(jié)果作坐標(biāo)圖，比較方法所得數(shù)值為橫坐標(biāo)，候選方法所得數(shù)值為縱坐標(biāo)，用以定性地估計分析誤差。進行雙份測定時，候選方法的第一次結(jié)果與對比方法的第一次結(jié)果作圖；第二次結(jié)果也如此。溶血、脂血、黃疸標(biāo)本，可在相應(yīng)的散點上標(biāo)以H、L、I等符號。每天測定的結(jié)果應(yīng)及時繪于圖上，以便及時檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)問題，對結(jié)果有矛盾的樣品，可取原樣重新測定。

⒋統(tǒng)計處理方法比較試驗所得的結(jié)果是配對資料，可進行配對資料的統(tǒng)計處理，包括配對t檢驗、相關(guān)和回歸分析等。通常都選用相關(guān)回歸分析方法，因為此法可以計算出所研究濃度范圍內(nèi)任一濃度的系統(tǒng)誤差。從回歸方程y＝a＋bx中，可顯示出候選方法有無系統(tǒng)性誤差。這種誤差分三類：恒定系統(tǒng)誤差與比例系統(tǒng)誤差，或兩者兼有。回歸線的截距a代表恒定誤差，回歸系數(shù)（回歸線的斜率)b代表比例誤差，相關(guān)系數(shù)r代表兩種方法的相關(guān)性是否密切。

實際情況并不簡單，X與Y值都有偶然誤差存在，b與a只是估計值，需要確定其可信限。在評價一種候選方法時，如果a＝0，b的數(shù)值稍偏離1.0，那么這種偏離程度是否小到可以忽略不計，因而使候選方法可以接受。這就需要參考a及b值的變動范圍，根據(jù)經(jīng)驗判斷是否可以適用于臨床檢驗的目的。在方法比較試驗中的相關(guān)系數(shù)r可作為候選方法可否接受的一種指針，但r值隨病人標(biāo)本測定范圍的增加而增大，因此，在配對資料分析中，不應(yīng)片面地根據(jù)相關(guān)系數(shù)r來判斷兩種方法分析結(jié)果的符合程度。