臨床生物化學(xué):第一節(jié)　概述

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)是隨著自然科學(xué)各基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展而發(fā)展。在臨床觀察的基礎(chǔ)上，其檢驗(yàn)、診斷、治療和病理生理學(xué)的進(jìn)展是與實(shí)驗(yàn)研究方法的創(chuàng)新與改進(jìn)分不開(kāi)的。分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，全面地滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中，揭示了許多新現(xiàn)象，提出了不少新問(wèn)題，是醫(yī)學(xué)向分子水平邁進(jìn)的一個(gè)重要依據(jù)和手段。使醫(yī)學(xué)科學(xué)達(dá)到了一個(gè)新的階段，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)已逐漸形成了比較完整的理論體系。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與診斷學(xué)也不例外，分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中的廣泛應(yīng)用，逐步形成診斷分子生物學(xué)（diagnostic molecular biology)這一學(xué)科分支。診斷分子生物學(xué)的內(nèi)容主要包括：

⒈內(nèi)源基因異常的檢驗(yàn)與診斷 在分子水平為疾病的發(fā)生機(jī)制，治療和預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。自身基因結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致基因功能異常而致病，或使其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能異常而致病，或使基因調(diào)控失常而致病，如遺傳性疾病、腫瘤等。

⒉外源基因侵入體內(nèi)的檢驗(yàn)與診斷 對(duì)多種病源微生物（如細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等)的檢出，可望實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、準(zhǔn)確。在分子水平可更準(zhǔn)確地分類(lèi)亞種和變種。探明病源微生物致病的機(jī)制。

生物大分子指核酸和蛋白質(zhì)分子，是生命物質(zhì)的基本要素，如最簡(jiǎn)單的生命體病毒、噬菌體僅以核酸，蛋白質(zhì)為主，卻表現(xiàn)了生命的最基本的功能。核酸的表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，為因果關(guān)系。核酸是生命的存在形式，蛋白質(zhì)是生命的表現(xiàn)形式。許多疾病的臨床表現(xiàn)與某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)，但究其原因可能是基因的結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)異常所為。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的檢驗(yàn)和臨床診斷應(yīng)用方法已日趨完善，而核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究歷史短，研究前景廣，是目前分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容。特別是在臨床檢驗(yàn)、診斷、預(yù)后、治療方面的開(kāi)發(fā)前景受到醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注。

核酸（nucleicacid)具有儲(chǔ)存和表達(dá)遺傳信息的功能，前者為脫氧核糖核酸（deoxyri-bonucleic acid，DNA)承擔(dān)，后者由核糖核酸（ribonucleic acid，RAN)參與。堿基（base)、脫氧核糖（deoxyribose)或核糖（ribose)、磷酸（phosphate)三種分子組成核苷酸（nucleotide)，核苷酸之間以磷酸二酯鍵在縱向按一定的排列順序組成核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，是鏈狀結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上形成二級(jí)或更高級(jí)的空間結(jié)構(gòu)，方能顯示其生物功能。

組成DNA的堿基有腺嘌呤（adenine A)、鳥(niǎo)嘌呤（guanine G)、胞嘧啶（cytosine C)和胸腺嘧啶（thymine T)，RNA的堿基為A、G、C和尿嘧啶（uracil U)。堿基在紫外光260nm波長(zhǎng)附近有較強(qiáng)吸收峰，該特性常用于核酸分析。堿基（嘌呤環(huán)的N-9或嘧啶環(huán)的N-1)與核糖（C-1′)以糖苷鍵結(jié)合形成核苷，核苷（C-5′)與磷酸以磷酸酯鍵結(jié)合形成核苷酸。核苷可與1-3個(gè)磷酸結(jié)合，如腺苷與一個(gè)磷酸結(jié)合為腺苷酸（AMP)，與二個(gè)磷酸結(jié)合為二磷酸腺苷（ADP)，與三個(gè)磷酸結(jié)合為三磷酸腺苷（ATP)。第一個(gè)核苷酸的C-3′位羥基與第二個(gè)核苷酸的C-5′位磷酸以磷酸二酯鍵結(jié)合，以此類(lèi)推成百上萬(wàn)的核苷酸結(jié)合可形成一條大分子核酸單鏈，單鏈之間的堿基再以氫鍵結(jié)合可形成較穩(wěn)定的核酸大分子雙鏈結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu))。

核酸的簡(jiǎn)寫(xiě)方式為5′AGCTGTAC3′，此外的英語(yǔ)字母已不代表堿基，而是指核苷酸。核酸的書(shū)寫(xiě)方向與合成方向一致，都是5′→3′。習(xí)慣上堿基原子次序不用‘′’而核糖環(huán)原子標(biāo)以‘′’，故5′表示核糖的C-5，并與磷酸基團(tuán)連接，3′為核糖的C-3，并帶有－OH基團(tuán)�？蓪�(xiě)作5′pAGCTGTAC－OH3′。

核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)以1953年Watson和Crick發(fā)表的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)最著名。DNA分子由兩條核苷酸組成的單鏈，按右手螺旋盤(pán)旋，兩條單鏈走向相反。兩條單鏈之間的橫向堿基A＝T以二個(gè)氫鍵配對(duì)，G≡C以三個(gè)氫鍵配對(duì)，使DNA分子的雙鏈之間有嚴(yán)格準(zhǔn)確的堿基配對(duì)關(guān)系bhskgw.cn/hushi/，形成DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上可形成超螺旋，即三級(jí)結(jié)構(gòu)。

DNA分子的一個(gè)重要物理性質(zhì)是在過(guò)酸、過(guò)堿或加熱的溶液中，雙鏈間的氫鍵可分開(kāi)成單鏈，稱(chēng)為變性。變性是可逆的，改變條件，解開(kāi)的單鏈可重新按堿基配對(duì)規(guī)則，A＝T、G≡C嚴(yán)格配對(duì)形成雙鏈，形成的雙鏈與變性前的結(jié)構(gòu)完全相同，稱(chēng)為復(fù)性。解鏈的DNA溶液在260nm處吸光值A(chǔ)₂₆₀增大，即核苷酸＞單鏈DNA＞雙鏈DNA，稱(chēng)為高色效應(yīng)，反之為低色效應(yīng)。以50μg/ml為例，A₂₆₀分別為：雙鏈DNA＝1.00，單鏈DNA＝1.34自由堿基＝1.60；或A₂₆₀＝1.00時(shí)雙鏈DNA＝50μg/ml，單鏈DNA＝37μg/ml，mRNA＝40μg/ml。一般同時(shí)在A₂₈₀測(cè)定蛋白質(zhì)含量，純化的DNa A₂₆₀/A₂₈₀≥1.8；純化的mRNaA₂₆₀/A₂₈₀≥2.0，即蛋白質(zhì)含量少。實(shí)驗(yàn)室常用加熱使DNA變性，因?yàn)镚≡C之間有三個(gè)氫鍵，而A＝T之間只有二個(gè)氫鍵，解鏈溫度取決于DNA分子中G≡C配對(duì)多少。以加熱溫度對(duì)A₂₆₀作圖可以得到一條解鏈曲線，解鏈開(kāi)始到完全解鏈的溫度范圍的中點(diǎn)溫度稱(chēng)為解鏈溫度（meltingtemperature，Tm)又稱(chēng)熔鏈溫度。Tm值大小與DNA的G＋C含量百分?jǐn)?shù)成正比。雖有推算Tm值的經(jīng)驗(yàn)公式Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)，但只能用于20個(gè)核苷酸以下的DNA小分子。而且實(shí)驗(yàn)條件可影響Tm。如三氯醋酸鈉存在使Tm變小，氯化鈉存在可使Tm升高。變性的DNA溶液經(jīng)處理后，使單鏈的堿基重新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程叫復(fù)性或退火。同源DNA復(fù)性叫復(fù)性DNA，不同源DNA復(fù)性的過(guò)程叫核酸雜交，形成的雙鏈叫雜化雙鏈。雜交可以發(fā)生在DNA分子之間，也可以發(fā)生在DNA與RNA分子之間，如DNA-DNA′；DNA-mRNA。影響復(fù)性的因素很多，如離子強(qiáng)bhskgw.cn/wsj/度、溫度、DNA濃度和長(zhǎng)度等，一般采用0.15-0.5mol/l NaCl；溫度低于Tm20-25℃，過(guò)高不利于復(fù)性，過(guò)低易發(fā)生單鏈內(nèi)堿基隨機(jī)配對(duì)或非特異性結(jié)合。復(fù)性的開(kāi)始是碰撞，因此DNA濃度高時(shí)，碰撞機(jī)會(huì)多，復(fù)性速度快。

DNA的生物功能是攜帶、傳遞和表達(dá)遺傳信息。基因是DNA大分子中一段有生物功能的片段。即在自然界可表達(dá)一分子具有生物活性的肽鏈，也可攜帶和傳遞給子代表達(dá)相同的肽鏈的信息�；�因組是所有基因的集合。

DNA堿基嚴(yán)格的配對(duì)，穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)可將攜帶的遺傳信息保留在生命體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)分為兩條單鏈，暴露堿基。在DNA合成酶作用下，兩條鏈各自為模板（母鏈)，按堿基配對(duì)原則合成與母鏈嚴(yán)格互補(bǔ)的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞的DNA分子一條鏈來(lái)自親代，一條是按堿基配對(duì)原則合成的新鏈，這一過(guò)程為復(fù)制，這種復(fù)制的方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制使子代與親代的DNA分子雙鏈堿基序列完全一致。遺傳信息就這樣準(zhǔn)確地傳遞給子代。復(fù)制過(guò)程以母鏈為模板，游離的脫氧三磷酸核苷為合成新鏈的原料，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，總稱(chēng)dNTP。催化新鏈合成反應(yīng)的酶是以DNA為模板的DNA聚合酶（DNA-dependentDNA polymerase)。DNA聚合酶需要一段寡核苷酸作為引物（primer)引導(dǎo)，以母鏈為模板，按堿基配對(duì)原則，將dNTP逐個(gè)由5′→3′方向合成新鏈，合成的新鏈走向5′→3′與母鏈3′→5′走向相反。1958年首先在大腸埃希菌發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ)，繼而發(fā)現(xiàn)原核生物有DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。聚合酶Ⅲ主要功能是復(fù)制，聚合酶Ⅰ的主要功能是在DNA堿基配對(duì)發(fā)生錯(cuò)誤或DNA損傷時(shí)起修復(fù)作用，聚合酶Ⅱ的功能尚不清楚。三種聚合酶均有從5′向3′或3′向5′逐一把核苷酸從核酸鏈上水解下來(lái)的核酸外切酶（exonuclease)作用。聚合酶Ⅰ外切酶活性最強(qiáng)，便于切除錯(cuò)誤和修復(fù)。用枯草菌溶素（蛋白酶)水解聚合酶Ⅰ后產(chǎn)生大、小片段，其中大自然切去了3′→5′的外切酶活性，保留5′→3′方向的聚合酶和外切酶活性，稱(chēng)為Klenow片段（Klenow fragment)，是分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA的另一個(gè)生物功能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息表達(dá)為具有生物功能的產(chǎn)物-基因產(chǎn)物，如肽鏈、酶、蛋白質(zhì)等。使遺傳得到表達(dá)，生命得以表現(xiàn)。

RNA有信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，生物功能主要轉(zhuǎn)錄DNA的遺傳信息，翻譯DNA的遺傳信息，表達(dá)DNA的遺傳信息。

合成RNA的過(guò)程為轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄酶是依賴DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNA polymerase)。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制有相似之外，均需依賴DNA的聚合酶，都以DNA為模板；均需核苷酸作原料，都為5′向3′延長(zhǎng)；且均遵從堿基配對(duì)原則。但也有明顯的不同之處，復(fù)制是把作為模板的DNA兩條母鏈均復(fù)制，而轉(zhuǎn)錄只轉(zhuǎn)錄DNA雙鏈中的有意義鏈；合成原料前者利用脫氧核苷酸mRNA、tRNA、rRNA三種RNA，且RNA中無(wú)胸腺嘧啶T，而以尿嘧啶U代替T，堿基配對(duì)也由A＝T轉(zhuǎn)為A＝U；參與復(fù)制的DNA聚合酶需引物，而用于轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶無(wú)需引物，自身有識(shí)別轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的功能。與復(fù)制不同的是轉(zhuǎn)錄只需以一條DNA鏈為模板，因此把可作為轉(zhuǎn)錄模板的一條DNA鏈稱(chēng)為有意義鏈（sense strand or Watson strand)，與此對(duì)應(yīng)的一條不參與轉(zhuǎn)錄的鏈稱(chēng)為反意義鏈（antisense strand or Crick strand)。有意義鏈并不固定在DNA雙鏈的某一條鏈上，而是在兩條鏈上交替出現(xiàn)，使轉(zhuǎn)錄也是交替進(jìn)行，這一現(xiàn)象稱(chēng)為不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的重要產(chǎn)物是mRNA，因?yàn)閙RNA可作為肽鏈合成的模板，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。由此把可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一段DNA稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因（structural gene)，其余的DNA可轉(zhuǎn)錄tRNA和rRNA，還有許多起調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)基因，但有相當(dāng)一部分的DNA功能尚不清楚，既不承擔(dān)轉(zhuǎn)錄功能也無(wú)調(diào)節(jié)作用。真核生物的基因往往是一種斷裂基因（splitegene)即一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，一條有意義鏈中的DNA堿基序列并不都能表達(dá)為蛋白質(zhì)�？杀磉_(dá)為蛋白質(zhì)的區(qū)域稱(chēng)編碼區(qū)，反之為非編碼區(qū)，編碼區(qū)與非編碼區(qū)在基因中相間排列。1978年，Gilbert把可編碼蛋白質(zhì)的DNA序列稱(chēng)外顯子（exon)，把非編碼稱(chēng)內(nèi)含子（intron)。真核細(xì)胞剛完成轉(zhuǎn)錄的mRNA含外顯子和內(nèi)含子，稱(chēng)雜化核RNA（heteroge-neous nuclear RNA，hnRNA)，這種初級(jí)mRNA的分子量往往比成熟的mRNA大幾倍。hnRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)剪接加工，切去內(nèi)含子，并在5′端加上7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和三磷酸鳥(niǎo)苷的帽子結(jié)構(gòu)（capstructure)在3′端加上多聚脫氧腺苷酸（poly A)后，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)為成熟的mRNA。

基因表達(dá)在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平及各水平表達(dá)后加工均可進(jìn)行調(diào)控。目前對(duì)原核生物的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究較多，較為清楚。原核生物中，功能相關(guān)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄出一段較長(zhǎng)的mRNA，稱(chēng)為多順?lè)粗�（polycistron)，并指導(dǎo)合成（翻譯)一套功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。這樣的一組基因及調(diào)節(jié)部分稱(chēng)為操縱子（operon)。乳糖操縱子（Lac operon)就是由調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子（promoter，p)、操縱區(qū)（operator，o)和表達(dá)β-半乳糖苷酶（Z)、β-半乳糖苷透性酶（Y)、β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（a)三種功能相關(guān)酶的相關(guān)基因組成。乳糖操縱子是可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控型操縱子，在高效誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導(dǎo)下，產(chǎn)生相應(yīng)的酶并作用底物5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，x-gal)產(chǎn)生藍(lán)色，在重組基因篩選中被廣泛應(yīng)用。有名的操縱子還有可誘導(dǎo)的正調(diào)控操縱子－阿拉伯糖操縱子（Ara operon)，可阻遏操縱子－色氨酸操縱子（Trp operon)�？烧T導(dǎo)指關(guān)閉的基因在誘導(dǎo)劑存在下可開(kāi)啟表達(dá)，可阻遏指開(kāi)放的基因在阻遏物存在下可關(guān)閉表達(dá)。

由轉(zhuǎn)錄把DNA上基因的信息（脫氧核苷酸序列)變?yōu)閙RNA核苷酸序列，生物體合成mRNA并把轉(zhuǎn)錄的信息（核苷酸序列)轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸序列的過(guò)程稱(chēng)翻譯。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核完成，翻譯在細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行。

翻譯從mRNA5′開(kāi)始，向3′方向每三個(gè)堿基為一個(gè)密碼（codon)，稱(chēng)三聯(lián)體密碼。4種堿基可組合64種密碼，代表了20種氨基酸和翻譯的起點(diǎn)與終止密碼，如5′-CGUGG　AUAA-3′代表精氨酸甘氨酸和終止密碼。密碼之間無(wú)標(biāo)點(diǎn)符號(hào)，當(dāng)多一個(gè)或少一個(gè)核苷酸時(shí)，可使密碼重排列移碼（frame shiff)，由此引起的變異稱(chēng)移碼突變。翻譯過(guò)程中以mRNA為模板，rRNA為場(chǎng)所，tRNA搬運(yùn)與密碼對(duì)應(yīng)的氨基酸，自mRNA5′端開(kāi)始合成多肽鏈，多肽鏈合成從氨基（N)端開(kāi)始，第一個(gè)氨基酸的羧基與第二個(gè)氨基酸的氨基形成肽鍵，在羧基（C)端結(jié)束。故肽鏈合成方向是N→C。經(jīng)翻譯后加工形成有活性的蛋白質(zhì)。

1958年，Crick把復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的基因表達(dá)（geneexpression)過(guò)程總結(jié)為分子生物學(xué)的中心法則（central dogma)。以后在病毒學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了依賴RNA的DNA聚合酶能進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，即反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，逆轉(zhuǎn)錄酶)，可以RNA為模板復(fù)制DNA，由此得到的DNA稱(chēng)cDNA（complementary DNA，互補(bǔ)DNA，反轉(zhuǎn)錄DNA)。后來(lái)還發(fā)現(xiàn)了RNA復(fù)制RNA，M₁₃噬菌體的DNA可以單鏈存在，有時(shí)DNA還能以三鏈、四鏈體形式存在，大大豐富了中心法則。