免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第五節(jié)　免疫復(fù)合物的檢測

免疫復(fù)合物在體內(nèi)存在有兩種方式，一是存在于血液中的循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC)，一是組織中固定的免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物的檢測技術(shù)可分為抗原特異性方法和非抗原特異性方法。在大多數(shù)情況下，免疫復(fù)合物中的抗原性質(zhì)不太清楚或非常復(fù)雜，所以抗原特異性方法并不常用。

一、循環(huán)免疫復(fù)合物的檢測

根據(jù)免疫復(fù)合物的物理學(xué)、免疫學(xué)和生物學(xué)特性，已經(jīng)設(shè)計(jì)出很多檢測CIC的方法（表24-4)，本章只述及常用的代表性方法。

表24-4 循環(huán)免疫復(fù)合物的常用檢測方法

（一)物理測定法

1．聚乙二醇法聚乙二醇（PEG)是乙二醇聚合而成的無電荷形多糖分子，分子量變化范圍較大，常用的分子量是6000。用3％～4％濃度的PEG可以選擇性地將大分子免疫復(fù)合物沉淀下來，其作用機(jī)制尚不甚清楚。將PEG溶液與待檢血清混合，置4℃冰箱過夜后離心，將沉淀物用PEG溶液充分洗滌，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波長280nm下測量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測定PEG沉淀的免疫復(fù)合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算CIC的含量。

聚乙二醇法簡單易行，可在臨床工作中推廣。但此法易受多種大分子蛋白和溫度的干擾，特異性稍差。PEG法還特別適用于沉淀獲得CIC，再進(jìn)行解離分析其中的抗原與抗體。

2．冷球蛋白測定在某些病理情況下，血清中的免疫復(fù)合物具有可逆性冷沉淀的特性，于4℃冰箱中放置1～3天可自發(fā)地沉淀下來（參見第二十六章)；此種情況多見于冷球蛋白血癥，所涉及的抗原包括自身的IgG、IgM、核苷酸、腫瘤相關(guān)抗原、腎小管上皮、甲狀腺球蛋白、紅細(xì)胞基質(zhì)等，還有外源性抗原如乙肝病毒、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、牛白蛋白和馬蛋白等。

（二)補(bǔ)體相關(guān)測定法

IgG和IgM類抗體與抗原結(jié)合后，重鏈CH2區(qū)的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)暴露，可以固定C1q并激活補(bǔ)體的系列反應(yīng)，這是利用補(bǔ)體有關(guān)技術(shù)檢測免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)。

1．C1q結(jié)合試驗(yàn)將待檢血清先行加熱56℃30min，以滅活其中的補(bǔ)體和破壞已與CIC結(jié)合的C1q，空出補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)。CIC與C1q的結(jié)合可用多種方法進(jìn)行檢測，常用的有以下3種。

（1)液相法：先將同位素標(biāo)記的C1q與滅活過的血清標(biāo)本混合作用，再加入0.5％（終濃度)的PEG將結(jié)合了C1q的CIC沉淀下來，通過檢測沉淀物中的放射活性來計(jì)算CIC的含量。

（2)固相法：先將C1q吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與C1q結(jié)合，再加入同位標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗人IgG或SPA，最后檢測其放射活性或酶活性。

（3)C1q偏離試驗(yàn)：先將同位素標(biāo)記的C1q與滅活的血清標(biāo)本混合，再加抗體致敏的綿羊紅細(xì)胞，溫育后離心，檢測紅細(xì)胞上的放射活性。紅細(xì)胞的放射活性與免疫復(fù)合物的量呈負(fù)相關(guān)。

2．補(bǔ)體試驗(yàn)本法的原理類似補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。將一定量的補(bǔ)體（多為混合豚鼠血清)與滅活的待檢血清混合溫育，反應(yīng)后加入致敏綿羊紅細(xì)胞。如出現(xiàn)溶血表示血清中沒有CIC存在；不溶血說明標(biāo)本中有CIC存在。將血清標(biāo)本做不同稀釋，并與已知的熱聚合IgG作對照，可以計(jì)算出CIC的含量。本方法的靈敏度較高，且易于在一般實(shí)驗(yàn)室開展，不足之處是特異性較差。

3．膠固素結(jié)合試驗(yàn)?zāi)z固素（conglutinin)是牛血清中的一種正常蛋白，能與C3d特異性結(jié)合；體內(nèi)與補(bǔ)體結(jié)合的CIC都帶有C3d，因此膠固素可與CIC結(jié)合。用一定量的膠固素包被塑料管，往管中加入稀釋的血清標(biāo)本，溫育后再加入同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，最后檢測各管的放射活性或酶活性，計(jì)算CIC的含量。

膠固素性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存、來源方便、價(jià)格便宜，檢測方法也不復(fù)雜，便于推廣。本法的不足是只能檢出已結(jié)合補(bǔ)體的CIC，但不論何種激活途徑都一樣檢出，并可用作CIC分離。

（三)抗球蛋白測定法

類風(fēng)濕因子（RF)為抗IgG的自身抗體，與變性IgG、熱聚合IgG和IC都有較強(qiáng)的親和力。單克隆RF（mRF)可從待發(fā)性冷球蛋白血癥的血清中提取，多克隆RF（pRF)可從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。

1．mRF固相抑制試驗(yàn)將mRF吸附于固相載體上，隨后加入血清標(biāo)本，再加入同位素標(biāo)記的可溶性熱聚合IgG。如果標(biāo)本中含有IC，固相mRF已與IC結(jié)合，熱聚合IgG與mRF的結(jié)合使被抑制，所以固相中的放射活性與CIC的含量呈負(fù)相關(guān)。

也可用同位素標(biāo)記的mRF先與血清標(biāo)本反應(yīng)，再加入熱聚合IgG附著的瓊脂糖bhskgw.cn珠，溫育并離心洗滌后測量沉淀物的放射強(qiáng)度，測定值與CIC的含量呈負(fù)相關(guān)。此法的敏感性比前法更高一些。

2．pRF膠乳凝集抑制試驗(yàn)將pRF與血清標(biāo)本混合，再加入IgG致敏的膠乳懸液。如果標(biāo)本中有CIC存在，則pRF先與之結(jié)合，凝集反應(yīng)呈陰性。

3．抗抗體法抗抗體可存在于極個(gè)別的健康人血清中，是一種抗IgGF(ab＇)₂的IgM類抗體，能與已結(jié)合抗原的IgG反應(yīng)，但不與游離的IgG或熱聚合IgG反應(yīng)，因而特異性較高。先將抗抗體與待檢血清混合，再加入IgG致敏的人O型Rh⁺紅細(xì)胞；如標(biāo)本中有CIC存在，抗抗體被中和，致敏紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集。

以上各種抗球蛋白試驗(yàn)以mRF法敏感性最高，但是mRF較難尋找。這類方法易受內(nèi)源性RF的干擾，最好先行檢查并除去標(biāo)本中的內(nèi)源性RF后再行試驗(yàn)。若遇標(biāo)本中有聚合Ig，RF法也易出現(xiàn)假陰性；改用抗抗體法可避免這種現(xiàn)象，但是抗抗體的來源困難。

（四)細(xì)胞技術(shù)測定

有些細(xì)胞表面具有Fc受體和（或)補(bǔ)體受體，可與免疫復(fù)合物相應(yīng)成分特異性結(jié)合，因而可用來對免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測。

1．Raji細(xì)胞試驗(yàn)Raji細(xì)胞是從Burkin淋巴瘤患者分離的一種B細(xì)胞株，表面有大量C1q、C3b和C3d受體，但無表面免疫球蛋白；因此Raji細(xì)胞能與帶有補(bǔ)體的免疫復(fù)合物結(jié)合。先在塑料管中加處一定量的Raji，再加入待檢血清，充分作用后離心洗滌；最后加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG，洗滌后細(xì)胞表面顯現(xiàn)熒光為試驗(yàn)陽性；但熒光法只能做定性檢測�；蚣尤胪�位素標(biāo)記的抗人IgG，離心洗滌后檢測沉淀細(xì)胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標(biāo)準(zhǔn)，可繪制出CIC含量與放射活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而求得待測標(biāo)本中CIC的含量。

Raji細(xì)胞法敏感性高、特異性強(qiáng)、方法簡單、不受DNA與內(nèi)毒素的影響；但Raji細(xì)胞表面還有Fc受體，因此被檢血清中的游離IgG通過Fc段與Raji細(xì)胞結(jié)合，造成假陽性。在待檢標(biāo)本中有抗淋巴細(xì)胞抗體時(shí)也可導(dǎo)致假陽性。再則，維持Raji細(xì)胞的培養(yǎng)較困難，培養(yǎng)條件的變化可改變Raji細(xì)胞表面受體的數(shù)目及親和性，影響檢測敏感性。

2．人紅細(xì)胞法人紅細(xì)胞表面具有C3b受體，可與帶有補(bǔ)體成分的CIC相結(jié)合。將待檢血清與4％的人O型紅細(xì)胞懸液等量混合，37℃溫育后離心洗滌；加入同位素標(biāo)記的抗人IgG抗體，再溫育洗滌后測定紅細(xì)胞的放射活性；以熱聚合IgG作參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出標(biāo)本中CIC含量。但該法只能檢測已結(jié)合補(bǔ)體的CIC。

其他細(xì)胞法如血小板凝集試驗(yàn)、玫瑰花環(huán)形bhskgw.cn/wsj/成抑制試驗(yàn)、ADCC抑制試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬抑制試驗(yàn)和中性粒細(xì)胞游走抑制試驗(yàn)等，也都可用來檢測CIC，方法的敏感性也都很高，但這些方法的影響因素多，可重復(fù)性差，所以實(shí)際中工作并不多用。

（五)免疫復(fù)合物的成分檢測

免疫復(fù)合物中抗原和抗體的性質(zhì)及各類的檢測對臨床診治疾病及深入研究疾病的免疫病理機(jī)制有一定價(jià)值。但是由于所涉及的抗原種類很多，例如病原微生物、自身物質(zhì)、各類同種抗原等，檢測方法可分別參見各種抗原的檢測技術(shù)。免疫復(fù)合物中的抗體主要涉及IgG及其亞類、IgM和IgA；方法是將血清中免疫復(fù)合物分離出來，再用雙抗體ELISA夾心法等方法分析抗體的類別。

循環(huán)免疫復(fù)合物的理想檢測方法應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①敏感性高，②特異性強(qiáng)，可重復(fù)性好，④操作簡便，⑤適用面廣。目前檢測免疫復(fù)合物的方法雖發(fā)展到幾十種，但還沒有一種方法具備上述所有的特點(diǎn)，綜合相比之下，C1q結(jié)合試驗(yàn)、膠固素結(jié)合試驗(yàn)、Raji細(xì)胞試驗(yàn)和RF抑制試驗(yàn)等方法比較好些。如果方法得當(dāng)、試劑合格、標(biāo)本新鮮、操作小心、分析謹(jǐn)慎、CIC測定就會(huì)有較大的參考價(jià)值。

二、組織固定免疫復(fù)合物的檢測

確定免疫復(fù)合物病的直接證據(jù)不是檢出CIC，而是在病變部位查到固定的IC沉積。在一些自身免疫病和免疫復(fù)合物病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、部分腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和尋常型天皰瘡等，組織沉積免疫復(fù)合物的檢出對疾病的診斷和發(fā)病機(jī)制的研究都比CIC的檢出更有意義。

檢測組織沉淀免疫復(fù)合物常用免疫組織化學(xué)技術(shù)，首先從適當(dāng)?shù)牟±聿课徊扇〗M織標(biāo)本做冰凍切片，用熒光標(biāo)記物的抗人IgG或抗人C3染色，在熒光顯微鏡下見到相應(yīng)部位顯示熒光為陽性反應(yīng)（詳見第十七章)；也可用酶標(biāo)抗人IgG或抗人C3與標(biāo)本切片反應(yīng)，再用酶的底物溶液顯色，用普通生物顯微鏡即可觀察到相應(yīng)部位被染色（詳見第十五章)。

三、免疫復(fù)合物檢測的意義及應(yīng)用

判定免疫復(fù)合物為發(fā)病機(jī)制的證據(jù)有三：①病變局部有IC沉積；②CIC水平顯著升高；③明確IC中的抗原性質(zhì)。第三條證據(jù)有時(shí)很難查到，但至少要具備前兩條，單獨(dú)CIC的測定不足為憑。人體在健康狀態(tài)下也存在少量的CIC（大約10～20μg/ml)，其生理與病理的界限不易區(qū)分。另外，CIC檢測的方法太多，其原理各不相同，用一種方法測定為陽性，另一種方法檢測可能為陰性；但與免疫組化法一起檢測，其意義就大得多。

目前已經(jīng)明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、部分腎小球腎炎和血管炎等疾病為免疫復(fù)合物病，CIC檢測對這些疾病仍是一種輔助診斷指標(biāo)，對判斷疾病活動(dòng)和治療效果也有一定意義。在發(fā)現(xiàn)紫癜、關(guān)節(jié)痛、蛋白尿、血管炎和漿膜炎等情況時(shí)，可考慮免疫復(fù)合物病的可能性，進(jìn)行CIC和組織沉積IC的檢測。另外，患有惡性腫瘤時(shí)CIC檢出率也增高，但不出現(xiàn)Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)的損傷癥狀，稱之為臨床隱匿的IC病，然而這種狀態(tài)常與腫瘤的病情和預(yù)后相關(guān)。