實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第四節(jié)　石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用

近10年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類基因組并非人們想象的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表達(dá)和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。

醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學(xué)研究的材料來源。在石蠟切片上進(jìn)行原位雜交或原位PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過對DNA或mRNA分析亦可直接證實(shí)或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學(xué)家較為熟悉的原位分子生物學(xué)技術(shù)，本節(jié)　不再贅述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986)成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要，結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細(xì)胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評估等方面均具有重要價值。本節(jié)　重點(diǎn)討論石蠟包埋組織DNA提取的方法學(xué)及其潛在的應(yīng)用前景。

一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法

從石蠟包埋組織中提取DNA的基本步驟，是在常規(guī)DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（1985)最先提出的石蠟包埋組織DNA提取技術(shù)（表18-5)，是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的石蠟，直接進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K（1mg/ml)的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。所得DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。Dubeau等（1986)在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1990)對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化DNA亦不影響雜交分析。

表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟

表18-6 TE9 DNA提取液的制備

5μm組織切片

↓

常規(guī)脫蠟、水化

↓

第一次溶液A孵育（去上清)

↓

第二次溶液A孵育（留上清)

↓

氯仿-異戊醇抽提

↓

RNA酶和蛋白酶消化

↓

酚抽提

↓

沉淀

↓

（卻除未螺旋化DNA)↓

透析

圖18-6　石蠟包埋組織DNA提取流程（Drbeau等，1986)

溶液A

不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb)，因?yàn)殡s交前要進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)則可在相對粗制的小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多，除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988)、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989)。這些方法不經(jīng)過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純化等步驟，直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h，DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，擴(kuò)增率較低，且重復(fù)性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標(biāo)本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。

二、影響DNA提取質(zhì)量的因素

1．固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（1988)對甲醛固定過程中DNA變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個階段：①早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化；②數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。

bramwell等（1988)發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA)可導(dǎo)致DNA明顯降解。Michel’s運(yùn)輸保存液或PBS存放組織雖提取DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀察到含苦味酸（Bouin氏液)和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs)處理標(biāo)本不能獲得完整的DNA。

乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑。Wu等（1990)用無水乙醇固定標(biāo)本48h，最長達(dá)2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm³乙醇固定標(biāo)本平均DNA產(chǎn)量為26.6μg,高于新鮮標(biāo)本（19.4μg/mm³)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。

Sato 等（1990)用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至4℃丙酮浸透，移至-20℃過夜。然而再用丙酮分別在4^℃和室溫脫水各15min，苯甲酸透明兩次，每次15min，最后60℃真空浸蠟2～3h，石蠟包埋。結(jié)果顯示，每10mg AMex法處理的濕重組織提高分子量DNA71.4±14.53μg，與新鮮組織產(chǎn)量相當(dāng)（70.4±13.76μg)。酶切、電泳和雜交反應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示AMex法是一種多用途組織處理技術(shù)，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA保存方法，特別適用于對形態(tài)學(xué)、免疫表型和基因改變的相關(guān)性分析。

2．固定時間對DNA的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA幾乎不發(fā)生反應(yīng)，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA提取的效率。如果事實(shí)果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz等沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對DNA提取質(zhì)量的明顯影響。Dubeau等認(rèn)為組織固定時間太短或太長均會導(dǎo)致DNA的降解。該作者對固定12h到5天不同時間間隔標(biāo)本的DNA提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化（Spoolable)的高分子量DNA明顯減少。固定5天后可螺旋化DNA提取率僅有8%。Warford等也發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞懸液經(jīng)30min福爾馬林固定后，DNA產(chǎn)量減少到30%，由此可見，不同標(biāo)本對不同固定劑所需的最佳固定時間應(yīng)摸索選定。根據(jù)Dubeau等經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)組織固定應(yīng)在12h以上至110之內(nèi)。

3．固定溫度等其他因素對DNA的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié)　，其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。室溫下DNA雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補(bǔ)多聚核苷酸；加熱到65℃時，氫鍵開始斷裂；約90^℃時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)下，甲醛與酸反應(yīng)很快，通過羥甲基化作用可抑制DNA冷卻后的再復(fù)性。

最近，Koshiba等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的DNA降解，是由于固定溫度高，pH低以及甲酸的存在所致。通過應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定（4℃)，可以明顯改善DNA保存。

酸性環(huán)境中DNA的降解已有過深入的研究。一般認(rèn)為，強(qiáng)酸可導(dǎo)致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng)pH達(dá)到2.5以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn)N-糖苷鍵水解，使嘌呤殘基游離；最后，多聚核苷之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強(qiáng)度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解DNA。福爾馬林中DNA降解的機(jī)理及其預(yù)防有待于進(jìn)一步研究。

4．組織處理過程對DNA的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之間，主要分布于100～1500bp，僅約1/3的組織所提取DNA>20kb。這除與固定劑、固定時間等因素有關(guān)外，可能的原因還有：①組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當(dāng)組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用；②不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用；③蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA大小無絕對區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存10年以上的標(biāo)本所獲得的DNA分子量大。可能蠟塊中仍存在導(dǎo)致DNA降解的因素。

組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致DNA變性，而產(chǎn)生單鏈DNA片段。單鏈DNA不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。

三、提高DNA提取質(zhì)量的方法

1．蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標(biāo)本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)�壞死部分切去后再用。盡可能地選用新近標(biāo)本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。

2．DNA提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進(jìn)行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA純化等問題上取得了進(jìn)展。①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DAN與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可達(dá)1mg/ml；作用時間一般為2～4天，最長可達(dá)7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶與組織充分接觸。Koshiba等發(fā)現(xiàn)，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和胍（guanidine)是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-巰基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者對DNA提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（4mol/L)尿素和2-巰基乙醇bhskgw.cn/wszg/。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。②DNA釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細(xì)胞密度和細(xì)胞外間質(zhì)的多少。對于細(xì)胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟)，通過24h孵育80%以上DNA可釋放出來；相同量的DNA釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6天時間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細(xì)胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當(dāng)調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。此外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的必要性，也有人提出異議。因?yàn)榈汀⒅蟹肿恿康暮怂岽嬖趯ο拗菩詢?nèi)切酶的消化和雜交不起作用。③Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進(jìn)行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學(xué)修飾的DNA，可通過攪起完整的DNA而被動除去，因而強(qiáng)調(diào)了螺旋化（spooling)在DNA純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA雜交信號強(qiáng)，而未螺旋化DNA信號減弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert 等認(rèn)為未螺旋化DNA不影響進(jìn)行點(diǎn)雜交分析。

3．避免DNA機(jī)械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達(dá)到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成3～5μm薄片，使每一細(xì)胞都被切開。但是，我們認(rèn)為切片太薄，容易過多地將DNA切斷，影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用15～20μm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化2～4天，使能達(dá)到細(xì)胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機(jī)械性勻漿過程造成的DNA剪切。

此外，在NDA釋放出來以后的提取過程中，應(yīng)盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應(yīng)選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE（pH8.0)溶解放4^℃保存即可，若短期不用時應(yīng)-20℃凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免DNA降解。

四、石蠟包埋組織DNA分析的方法學(xué)

由于DNA提取方法的改善和DNA質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學(xué)研究的常用方法是點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)。

1．點(diǎn)雜交鑒于包埋組織DNA有一定程度的降解，因而點(diǎn)雜交被認(rèn)為是一種簡便、快速和實(shí)用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall – smith等（1988)采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點(diǎn)膜，進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，在3周內(nèi)對200多病例進(jìn)行篩選，對陽性病例和很難解釋的弱陽性斑點(diǎn)，再進(jìn)行原位雜交等方法作進(jìn)一步證實(shí)。

2．Southern印跡雜交Southern印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地用于基因突變，擴(kuò)增、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern印跡雜交分析有以下幾個方面值得注意：

（1)當(dāng)所分析的酶切片段長為300～500bp時，包埋組織DNA雜交信號強(qiáng)度只有相同量標(biāo)準(zhǔn)DNA的10%～85%。信號強(qiáng)度與原始DNA大小呈正相關(guān)，最小片段DNA產(chǎn)生最弱的信號。

（2)包埋組織DNA所致的非特異性背景雜交比標(biāo)準(zhǔn)DNA為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由于不包含到分析基因中兩個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的小片段DNA存在。

（3)由于背景雜交明顯使得信號模糊，信/噪比縮小。根據(jù)Goelz的經(jīng)驗(yàn)，約有25%石蠟包埋組織不適于作Southern印跡雜交。

（4)某些限制性酶切片段的電泳速度比標(biāo)準(zhǔn)DNA稍遲緩�？赡艿脑�因是DNA直接或間接的化學(xué)改變使某些限制性酶切位點(diǎn)失活和/或單鏈DNA存在。

（5)由于小片段DNA的存在，故用作雜交分析的DNA量應(yīng)適當(dāng)增加，以增強(qiáng)雜交信號。

3．PCR分析PCR技術(shù)是近年來分子生物學(xué)技術(shù)的典范，已被廣泛地用于分子病理學(xué)的各個領(lǐng)域。此技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡便、快速、模板DNA要求不高，特別適于石蠟包埋DNA的分析。

用于PCR擴(kuò)增的DNA提取比較簡單，既使少量DNA樣品亦能產(chǎn)生大量特異性DNA拷貝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm²的HE染色切片提取的DNA亦可獲得滿意的擴(kuò)增，并可用于診斷。但是，為了提高PCR的敏感性和可重復(fù)性，模板DNA應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應(yīng)的成份。

此外，切片過程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽性。

最近，Davis等（1993)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP)分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是應(yīng)用單鏈DNA在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來分析PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測出小到一個堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點(diǎn)突變和基因多態(tài)性。

此外，在包埋組織的DNA提取中往往發(fā)現(xiàn)有RNA的存在。這些未加任何保護(hù)而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。然而，此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為Northern印跡雜交分析的可能材料來源。

五、分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用

1．基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細(xì)胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig)和T-細(xì)胞受體（TCR)基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標(biāo)，這在國外許多實(shí)驗(yàn)室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。

Southern印跡雜交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義：①惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細(xì)胞增生，不能檢出或擴(kuò)增出克隆性基因重排序列；②T和B細(xì)胞性腫瘤的區(qū)分：PCRβ基因重排支持T細(xì)胞源性，而Ig重鏈基因則為B細(xì)胞源性。然而，一部分病例顯示Ig和TCR基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同時伴有Ig輕鏈（K或人)基因重排則支持B細(xì)胞腫瘤；同時伴有TCRr或TCRs基因重排則為T細(xì)胞腫瘤。另外，也可結(jié)合免疫分型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因?yàn)椴煌耆�重排、不伴有相�?yīng)的抗原受體表達(dá)，故免疫表型上往往是單一的。③T細(xì)胞性淋巴瘤的診斷，T細(xì)胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無克隆性標(biāo)記，故對此類淋巴瘤均有必要進(jìn)行基因分型。④T細(xì)胞優(yōu)勢性B細(xì)胞淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。⑤殘留病變監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識別骨髓的累及、治療或骨髓移植后殘余病變的檢測，以及形態(tài)學(xué)上不能察覺的早期復(fù)發(fā)的診斷。

某些淋巴瘤/白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類型的基因重排標(biāo)記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的t（14：18)易位，Burkitt氏淋巴瘤的t（8：14)、t（8：2)和t（8：22)易位，以及慢�；蚣绷馨籽�病中常見的t（9：33)易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價值不大。

2．癌基因與抗癌基因的研究分子生物學(xué)在腫瘤病理學(xué)中另一熱點(diǎn)是癌基因和抗癌基因的研究。自從1981年Weinberg 等首先報道人癌基因分離成功以來，至今已有50多種癌基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因普遍存在于各種生物細(xì)胞中，對于細(xì)胞的生長和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控；病理狀態(tài)下，癌基因活化，表達(dá)失控，使細(xì)胞原有的正常生物學(xué)性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。據(jù)報道，癌基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見于造血系統(tǒng)、乳腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。

另一類基因稱抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、Rb、DCC、WT₁和NF₁等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達(dá)失控，而誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。

目前，對人類腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測，已經(jīng)在腫瘤的分類、發(fā)病機(jī)理、腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。

（1)癌變機(jī)理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。已有大量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過度表達(dá)，一種癌基因?qū)Π屑?xì)胞的永生化起重要作用，而另一種則促進(jìn)細(xì)胞的永生化。

（2)腫瘤生物學(xué)待業(yè)和預(yù)后的研究：某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過度表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是c –erbB –2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等（1992)發(fā)現(xiàn)，浸潤性導(dǎo)管癌中c – erbB –2陽性表達(dá)率達(dá)67%以上，單純癌陽性率為26.5%，而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c –erbB –2 過度表達(dá)的乳腺癌預(yù)后不良，Schimmelpenning等（1992)也報告伴有c –erbB –2 擴(kuò)增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周圍浸潤。此外，ras P21在乳腺癌中的表達(dá)也有上述趨勢。

（3)輔助診斷和鑒別診斷：bc1-2基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽性表達(dá)率在80%以上，而后者幾乎為陰性；ras癌基因突變或過度表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細(xì)胞肺癌常伴有n –myc突變。

（4)癌細(xì)胞的組織發(fā)生：paget氏病可分乳腺外（EPD)和乳腺內(nèi)（MPD)兩種。有關(guān)paget細(xì)胞的起源問題仍有爭議。許良中（1993)觀察了c –erbB –2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達(dá)，認(rèn)為MPD中的paget細(xì)胞是來源于腺癌細(xì)胞而不是表皮的角質(zhì)層細(xì)胞。EPP中的paget細(xì)胞也來源于腺癌細(xì)胞，但這種腺癌細(xì)胞與MPD中的腺癌細(xì)胞不同，因?yàn)閮烧呋�因表達(dá)不同。

3．遺傳病的基因診斷遺傳病的回顧性家族調(diào)查，可通過石蠟包埋組織完成。Mueller等描述1例懷疑囊性纖維化（CF)的死嬰，石蠟包埋組織是唯一的材料來源。應(yīng)用CF基因標(biāo)記引物，對患兒和其父母的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)內(nèi)切酶消化并檢測限制性片段多態(tài)性。結(jié)果顯示父母和患兒在同一位點(diǎn)上有意義，表明患兒遺傳有突變型CF基因，最后證實(shí)了CF的診斷。

另一種常見的遺傳病–肌營養(yǎng)不良癥（DMD)，是由Dystrophin基因的DNA序列畸變引起。Forstboefel等用該基因的已知編碼DNA序列，從一死嬰尸檢組織中得到的DNA進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMD基因的一關(guān)鍵部分缺失，進(jìn)而證實(shí)了DMD的診斷。同樣可通過親代DNA分析，區(qū)分遺傳性或散發(fā)性缺失。

4．病理微生物的檢測核酸雜交和PCR技術(shù)對病原微生物的檢測亦具有獨(dú)到之處，除其特異性和敏感性極高外，還可適用于石蠟切片等多種材料，且可避免因培養(yǎng)造成的病原擴(kuò)散。特別是一些原位雜交和PCR診斷性試劑盒的問世，使此項(xiàng)檢測更加簡便易行。因此，分子生物學(xué)將是傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展方向。這方面的應(yīng)用已有很多報道，本節(jié)　不再贅述。

5．組織來源的鑒定PCR可用于選擇性擴(kuò)增一部分HLa–DQa 基因，這部分是人類基因組中高度多肽性的位點(diǎn)。DNA序列微小的個體差異，可被特異性cDNA探針區(qū)分。此基因在人群中的正常變異是有圖譜的，故可將其用作“基因指紋”來驗(yàn)證組織來源。在日常工作中偶爾遇到標(biāo)本的標(biāo)記錯誤，當(dāng)觀察組織切片，發(fā)現(xiàn)與臨床資料不匹配時才被發(fā)現(xiàn)。Shibata等通過分析石蠟標(biāo)本DNA中HLa–DQa位點(diǎn)解決了這一難題。另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受體基因，亦可同樣用于標(biāo)本的鑒定。

Dubeau等發(fā)現(xiàn)提取DNA的甲基化類型是恒定的，包埋組織仍保留其原有的特異性甲基化特征，籍此可有助于識別某些腫瘤的起源組織。

綜上所述，石蠟包埋組織DNA的提取擴(kuò)展了分子生物學(xué)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用范圍。雖然現(xiàn)在回顧性DNA分析僅用于確定少數(shù)特異性診斷，但隨著越來越多的感染性病原基因、特異性腫瘤基因和遺傳病基因的識別和克隆，相信不遠(yuǎn)的將來基因診斷的應(yīng)用范圍會進(jìn)一步拓寬，分子雜交等基因分析技術(shù)將會在病理學(xué)診斷和研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

（張建中)