生物化學(xué)與分子生物學(xué):第二節(jié)　呼　吸　鏈

呼吸鏈(respiratorychain)是由一系列的遞氫體(hydrogen transfer)和遞電子體(eletron transfer)按一定的順序排列所組成的連續(xù)反應(yīng)體系，它將代謝物脫下的成對(duì)氫原子交給氧生成水，同時(shí)有ATP生成。實(shí)際上呼吸鏈的作用代表著線粒體最基本的功能，呼吸鏈中的遞氫體和遞電子體就是能傳遞氫原子或電子的載體，由于氫原子可以看作是由H+和e組成的，所以遞氫體也是遞電子體，遞氫體和遞電子體的本質(zhì)是酶、輔酶、輔基或輔因子。

一、呼吸鏈的組成

構(gòu)成呼吸鏈的遞氫體和遞電子體主要分為以下五類

(一)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或稱輔酶I(CoI)。

為體內(nèi)很多脫氫酶的輔酶，是連接作用物與呼吸鏈的重要環(huán)節(jié)，分子中除含尼克酰胺(維生素PP)外，還含有核糖、磷酸及一分子腺苷酸(AMP)，其結(jié)構(gòu)如下：

NAD+的主要功能是接受從代謝物上脫下的2H(2H++2e)，然后傳給另一傳遞體黃素蛋白。

在生理pH條件下，尼克酰胺中的氮(吡啶氮)為五價(jià)的氮，它能可逆地接受電子而成為三價(jià)氮，與氮對(duì)位的碳也較活潑，能可逆地加氫還原，故可將NAD+視為遞氫體。反應(yīng)時(shí)，NAD+的尼克酰胺部分可接受一個(gè)氫原子及一個(gè)電子，尚有一個(gè)質(zhì)子(H+)留在介質(zhì)中。

此外，亦有不少脫氫酶的輔酶為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，又稱輔酶Ⅱ(CoⅡ)，它與NAD+不同之處是在腺苷酸部分中核糖的2′位碳上羥基的氫被磷酸基取代而成。

當(dāng)此類酶催化代謝物脫氫后，其輔酶NADP+接受氫而被還原生成NADPH+H+，它須經(jīng)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(pyridine nucleotidetranshydrogenase)作用將還原當(dāng)量轉(zhuǎn)移給NAD+，然后再經(jīng)呼吸鏈傳遞，但NADPH+H+一般是為合成代謝或羥化反應(yīng)提供氫。

(二)黃素蛋白(flavoproteins)

黃素蛋白種類很多，其輔基有兩種，一種為黃素單核苷酸(FMN)，另一種為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，兩者均含核黃素(維生素B2)，此外FMN尚含一分子磷酸，而FAD則比FMN多含一分子腺苷酸(AMP)，其結(jié)構(gòu)如下：

在FAD、FMN分子中的異咯嗪部分可以進(jìn)行可逆的脫氫加氫反應(yīng)。

FAD或FMN與酶蛋白部分之間是通過非共價(jià)鍵相連，但結(jié)合牢固，因此氧化與還原(即電子的失與得)都在同一個(gè)酶蛋白上進(jìn)行，故黃素核苷酸的氧化還原電位取決于和它們結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)還原電位指的是特定的黃素蛋白，而不是游離的FMN或FAD；在電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)中它們只是在黃素蛋白的活性中心部分，而其本身不能作為作用物或產(chǎn)物，這和NAD+不同，NAD+與酶蛋白結(jié)合疏松，當(dāng)與某酶蛋白結(jié)合時(shí)可以從代謝物接受氫，而被還原為NADH，后者可以游離，再與另一種酶蛋白結(jié)合，釋放氫后又被氧化為NAD+。

多數(shù)黃素蛋白參與呼吸鏈組成，與電子轉(zhuǎn)移有關(guān)，如NADH脫氫酶(NADh dehydrogenase)以FMN為輔基，是呼吸鏈的組分之一，介于NADH與其它電子傳遞體之間；琥珀酸脫氫酶，線粒體內(nèi)的甘油磷酸脫氫酶(glycerol phosphate dehydrogenase)的輔基為FAD，它們可直接從作用物轉(zhuǎn)移還原當(dāng)量H++e reducing equivalent)到呼吸鏈，此外脂肪酰CoA脫氫酶與琥珀酸脫氫酶相似，亦屬于FAD為輔基的黃素蛋白類，也能將還原當(dāng)量從作用物傳遞進(jìn)入呼吸鏈，但中間尚需另一電子傳遞體稱為電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(electron�瞭ransferring flavo�瞤rotein,ETFP，輔基為FAD)參與才能完成。

(三)鐵硫蛋白(iron�瞫ulfur proteins,Fe-S)

又稱鐵硫中心，其特點(diǎn)是含鐵原子。鐵是與無機(jī)硫原子或是蛋白質(zhì)肽鏈上半胱氨酸殘基的硫相結(jié)合，常見的鐵硫蛋白有三種組合方式(a)單個(gè)鐵原子與4個(gè)半胱氨酸殘基上的巰基硫相連。(b)兩個(gè)鐵原子、兩個(gè)無機(jī)硫原子組成(2Fe-2S)，其中每個(gè)鐵原子還各與兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基硫相結(jié)合。(c)由4個(gè)鐵原子與4個(gè)無機(jī)硫原子相連(4Fe��4S)，鐵與硫相間排列在一個(gè)正六面體的8個(gè)頂角端；此外4個(gè)鐵原子還各與一個(gè)半胱氨酸殘基上的巰基硫相連(圖6-1)。

圖6－1　鐵硫蛋白結(jié)構(gòu)

(a)單個(gè)鐵與半胱氨酸硫相連　(b)2Fe-2S　(c)4Fe-4S

鐵硫蛋白中的鐵可以呈兩價(jià)(還原型)，也可呈三價(jià)(氧化型)，由于鐵的氧化、還原而達(dá)到傳遞電子作用。

在呼吸鏈中它多與黃素蛋白或細(xì)胞色素b結(jié)合存在。

(四)泛醌(ubiquinone,UQ或Q)

亦稱輔酶Q(coenzymeQ)，為一脂溶性苯醌，帶有一很長的側(cè)鏈，是由多個(gè)異戊二烯(isoprene)單位構(gòu)成的，不同來源的泛醌其異戊二烯單位的數(shù)目不同，在哺乳類動(dòng)物組織中最多見的泛醌其側(cè)鏈由10個(gè)異戊二烯單位組成。

泛醌接受一個(gè)電子和一個(gè)質(zhì)子還原成半醌，再接受一個(gè)電子和質(zhì)子則還原成二氫泛醌，后者又可脫去電子和質(zhì)子而被氧化恢復(fù)為泛醌。

(五)細(xì)胞色素體系

1926年Keilin首次使用分光鏡觀察昆蟲飛翔肌振動(dòng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有特殊的吸收光譜，因此把細(xì)胞內(nèi)的吸光物質(zhì)定名為細(xì)胞色素。細(xì)胞色素是一類含有鐵卟啉輔基的色蛋白，屬于遞電子體。線粒體內(nèi)膜中有細(xì)胞色素b、c1、c、aa3，肝、腎等組織的微粒體中有細(xì)胞色素P450。細(xì)胞色素b、c1、c為紅色細(xì)胞素，細(xì)胞色素aa3為綠色細(xì)胞素。不同的細(xì)胞色素具有不同的吸收光譜，不但其酶蛋白結(jié)構(gòu)不同，輔基的結(jié)構(gòu)也有一些差異。

細(xì)胞色素c為一外周蛋白，位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)。細(xì)胞色素C比較容易分離提純，其結(jié)構(gòu)已清楚。哺乳動(dòng)物的Cyt c由104個(gè)氨基酸殘基組成，并從進(jìn)化的角度作了許多研究。Cyt c的輔基血紅素(亞鐵原卟啉)通過共價(jià)鍵(硫醚鍵)與酶蛋白相連(見圖6-2)，其余各種細(xì)胞色素中輔基與酶蛋白均通過非共價(jià)鍵結(jié)合。

圖6－2　細(xì)胞色素C的輔基與酶蛋白的聯(lián)接方式

細(xì)胞色素a和a3不易分開，統(tǒng)稱為細(xì)胞色素aa3。和細(xì)胞色素P450、b、c1、c不同，細(xì)胞色素aa3的輔基不是血紅素，而是血紅素A(見圖6?)。細(xì)胞色素aa3可將電子直接傳遞給氧，因此又稱為細(xì)胞色素氧化酶。

圖6-3　血紅素A結(jié)構(gòu)式

鐵卟啉輔基所含F(xiàn)e2+可有Fe2+←→Fe3++e的互變，因此起到傳遞電子的作用。鐵原子可以和酶蛋白及卟啉環(huán)形成6個(gè)配位鍵。細(xì)胞色素aa3和P��450輔基中的鐵原子只形成5個(gè)配位鍵，還能與氧再形成一個(gè)配位鍵，將電子直接傳遞給氧，也可與CO、氰化物、H2S或疊氮化合物形成一個(gè)配位鍵。細(xì)胞色素aa3與氰化物結(jié)合就阻斷了整個(gè)呼吸鏈的電子傳遞，引起氰化物中毒。

二、呼吸鏈中各種傳遞體的排列順序

(一)確定排列順序的方法

1.標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位的數(shù)值表示氧化還原能力的大小，標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位負(fù)值越大，其還原性越強(qiáng)，容易被氧化；標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位正值越大，其氧化性越強(qiáng)，容易被還原。因此呼吸鏈中各種組分的排列順序應(yīng)當(dāng)由低電位依次向高電位排列(圖－4)。

圖6-4　各種傳遞體的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位

2.還原程度來確定。Chance和Williams使用分光光度法測定離體的線粒體在有氧條件下三羧酸循環(huán)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，呼吸鏈中各種傳遞體的還原程度。反應(yīng)達(dá)到平衡bhskgw.cn/kuaiji/時(shí)從底物一側(cè)到氧一側(cè)的各種傳遞體的還原程度應(yīng)當(dāng)是遞減的，底物的一側(cè)最高，氧一側(cè)最低，如下表中數(shù)據(jù)所示。

表6-1　有氧動(dòng)態(tài)平衡時(shí)電子傳遞體的還原程度

FP：黃素蛋白

這種情況好象物理學(xué)上的聯(lián)通管，圖6?A中，若進(jìn)水量等于出水量，即流量達(dá)到平衡時(shí)，離進(jìn)水口最近的水管中水位最高，離出水管最近的水管中水位最低，從進(jìn)水管到出水管水位逐漸減低，若把水流視為電子流，就是上述實(shí)驗(yàn)中的情況。

3.使用特異的抑制劑　特異的抑制劑能阻斷呼吸鏈中的特定環(huán)節(jié)，阻斷部位的底物一側(cè)的各種傳遞體應(yīng)為還原型，阻斷部位的氧一側(cè)的各種傳遞體應(yīng)為氧化型，正象我們阻斷聯(lián)通管的底部一樣，阻斷部位以前的各水管中水是滿的，而阻斷部位以后的各水管中水均流光(見圖6-5，B)。

圖6-5　有氧氧化穩(wěn)定時(shí)各種傳遞體的還原太分?jǐn)?shù)

A.不加抑制劑　B.加入抗霉A阻斷

復(fù)合物Ⅰ：催化NADH氧化、CoQ還原。

復(fù)合物Ⅱ：催化琥珀酸氧化、CoQ還原

復(fù)合物Ⅲ：催化Co QH2氧化、Cyt c還原

復(fù)合物Ⅳ：催化Cyt c氧化、O2還原

表6-2　使用抗霉素A前后各種遞電子體的還原型百分?jǐn)?shù)

從表中可以看出，F(xiàn)P、Cyt b位于抗霉素A阻斷部位之前，Cytc、cl、aa3位于阻斷部位之后。用不同的抑制劑作此實(shí)驗(yàn)，就可以確定呼吸鏈中各種傳遞體的排列順序。

4.在體外實(shí)驗(yàn)中，將線粒體分成各種復(fù)合物，檢測其各自催化的反應(yīng)，再將其重組，檢測其催化能力。

美國格林(Green)等實(shí)驗(yàn)室成功地將呼吸鏈分離成具有催化活性的四種復(fù)合物以及CoQ和Cytc.檢測各個(gè)復(fù)合物的功能發(fā)現(xiàn)：

可以看出CoQ在復(fù)合物Ⅰ與Ⅲ，Ⅱ與Ⅲ之間傳遞還原當(dāng)量，Cyt c在復(fù)合物Ⅲ與Ⅳ之間傳遞還原當(dāng)量。他們又將這四種復(fù)合物1：1：1：1的比例混合，加上CoQ和Cyt c重組，基本上恢復(fù)了線粒體原有的催化能力。

借助上述實(shí)驗(yàn)方法，呼吸鏈各組分的排列順序已基本明確，但仍有些不一致的看法，其中以CoQ至細(xì)胞色素C這一部分研究得還很不清楚，對(duì)于Fe-S和CoQ的定位和數(shù)量也有爭議。

(二)氧化呼吸鏈

1.NADH氧化呼吸鏈　人體內(nèi)大多數(shù)脫氫酶都以NAD+作輔酶，在脫氫酶催化下底物SH2脫下的氫交給NAD+生成NADH+H+，在NADH脫氫酶作用下，NADH+H+將兩個(gè)氫原子傳遞給FMN生成FMNH2，再將氫傳遞至CoQ生成CoQH2，此時(shí)兩個(gè)氫原子解離成2H++2e,2H+游離于介質(zhì)中，2e經(jīng)Cyt b、c1、c、aa3傳遞，最后將2e傳遞給1/2O2，生成O2-,O2與介質(zhì)中游離的2H+結(jié)合生成水，綜合上述傳遞過程可用圖6-6表示。

圖6-6　NADH氧化呼吸鏈

SH2：作用物；(Fe-S)：鐵硫中心；Cyt:細(xì)胞色素

2.琥珀酸氧化呼吸鏈　琥珀酸在琥珀酸脫氫酶作用下脫氫生成延胡索酸，F(xiàn)AD接受兩個(gè)氫原子生成FADH2，然后再將氫傳遞給CoQ，生成CoQH2，此后的傳遞和NADH氧化呼吸鏈相同，整個(gè)傳遞過程可用圖6－7表示。

圖6-7　琥珀酸氧化呼吸鏈

(Fe-S)：鐵硫中心：b:琥珀酸脫氫酶復(fù)合體的細(xì)胞色素

3.線粒體氧化呼吸鏈總結(jié)　線粒體中物質(zhì)代謝會(huì)生成大量的NADH+H+和FADH2-它們可來自丙酮酸氧化脫羧、三羧酸循環(huán)、脂肪酸的β-氧化和L-谷氨酸的氧化脫氨等反應(yīng)，現(xiàn)將某些重要底物氧化時(shí)的呼吸鏈總結(jié)于圖6－8。

圖6-8　線粒體中某些底物氧化時(shí)的呼吸鏈

*ETF：電子傳遞黃素蛋白，輔基為FAD

三、胞漿中NADH的轉(zhuǎn)移

體內(nèi)很多物質(zhì)氧化分解產(chǎn)生NADH，反應(yīng)發(fā)生在線粒體內(nèi)，則產(chǎn)生的NADH可直接通過呼吸鏈進(jìn)行氧化磷酸化，但亦有不少反應(yīng)是在線粒體外進(jìn)行的，如3-磷酸甘油醛脫氫反應(yīng)，乳酸脫氫反應(yīng)及氨基酸聯(lián)合脫氨基反應(yīng)等等。由于所產(chǎn)生的NADH存在于線粒體外，而真核細(xì)胞中，NADH不能自由通過線粒體內(nèi)膜，因此，必須借助某些能自由通過線粒體內(nèi)膜的物質(zhì)才能被轉(zhuǎn)入線粒體，這就是所謂穿梭機(jī)制，體內(nèi)主要有兩種穿梭機(jī)制。

1.α磷酸甘油穿梭(glycerol�拨�-phosphateshuttle)

該穿梭機(jī)制主要在腦及骨骼肌中，它是借助于α-磷酸甘油與磷酸二羥丙酮之間的氧化還原轉(zhuǎn)移還原當(dāng)量，使線粒體外來自NADH的還原當(dāng)量進(jìn)入線粒體的呼吸鏈氧化，具體過程如圖6-9。

圖6-9　α磷酸甘油穿

當(dāng)胞液中NADH濃度升高時(shí)，胞液中的磷酸二羥丙酮首先被NADH還原成α磷酸甘油(3－磷酸甘油)，反應(yīng)由甘油磷酸脫氫酶(輔酶為NAD+)催化，生成的α磷酸甘油可再經(jīng)位于線粒體內(nèi)膜近外側(cè)部的甘油磷酸脫氫酶催化氧化生成磷酸二羥丙酮。線粒體與胞液中的甘油磷酸脫氫酶為同工酶，兩者不bhskgw.cn/jianyan/同在于線粒體內(nèi)的酶是以FAD為輔基的脫氫酶，而不是NADH+，F(xiàn)AD所接受的質(zhì)子、電子可直接經(jīng)泛醌、復(fù)合體Ⅲ、Ⅳ傳遞到氧，這樣線粒體外的還原當(dāng)量就被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體氧化了，但通過這種穿梭機(jī)制果只能生成2分子ATP而不是3分子ATP。

2.蘋果酸，天冬氨酸穿梭(malate aspartate shuttle)：

這種穿梭機(jī)制主要在肝、腎、心中發(fā)揮作用，其穿梭機(jī)制比較復(fù)雜，不僅需借助蘋果酸、草酸乙酸的氧化還原，而且還要借助α酮酸與氨基酸之間的轉(zhuǎn)換，才能使胞液中來的NADH的還原當(dāng)量轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體氧化，具體過程如圖6－10。

圖6-10　蘋果酸天冬氨酸穿梭

GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酸；MDH：蘋果酸脫氫酶

當(dāng)胞液中NADH濃度升高時(shí)，首先還原草酰乙酸成為蘋果酸，此反應(yīng)由蘋果酸脫氫酶催化，胞液中增多的蘋果酸可通過內(nèi)膜上的二羧酸載體系統(tǒng)與線粒體內(nèi)的α酮戊二酸交換；進(jìn)入線粒體的蘋果酸，經(jīng)蘋果酸脫氫酶催化又氧化生成草酰乙酸并釋出NADH，還原當(dāng)量從復(fù)合體I進(jìn)入呼吸鏈經(jīng)CoQ、復(fù)合體Ⅲ、Ⅳ傳遞，最image/005061360后給氧，所以仍可產(chǎn)生3分子ATP，與在線粒體內(nèi)產(chǎn)生的NADH氧化相同。與此同時(shí)線粒體內(nèi)的α酮戊二酸由于與蘋果酸交換而減少，需要補(bǔ)充，于是在轉(zhuǎn)氨酶作用下由谷氨酸與草酰乙酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成α酮戊二酸和天冬氨酸，天冬氨酸借線粒體膜上的谷氨酸天冬氨酸載體轉(zhuǎn)移系統(tǒng)與胞液的谷氨酸交換，從而補(bǔ)充了線粒體內(nèi)谷氨酸由于轉(zhuǎn)氨基作用而造成的損失，進(jìn)入胞液的天冬氨酸再與胞液中α酮戊二酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨基，重新又產(chǎn)生草酰乙酸以補(bǔ)充最初的消耗，從而完成整個(gè)穿梭過程。