1 中和用病毒懸液的制備
要求中和用病毒懸液經(jīng)37℃水浴作用1小時的LD50在32～320之間。
1.1病毒株的選擇：選用CVS毒種。
1.2 病毒株的傳代：取CVS毒種（一般為凍干毒種)制成10-2懸液，腦內(nèi)接種體重10～12g健康小白鼠0.03ml，待發(fā)病后取腦再制成10-2懸液，接種于小白鼠腦內(nèi)進行傳代，一般傳至2～3代即可制成凍干中和用病毒或–70℃凍存的中和用病毒，但要選用小白鼠在第5天發(fā)病并麻痹的服制備。
1.3 凍干病毒的制備：用第5天發(fā)病并麻痹的鼠腦以脫脂牛乳研磨稀釋成20%的腦懸液，按0.5ml分裝安瓿凍干后真空封口，存bhskgw.cn/yaoshi/-30℃待用。
1.4-70℃凍存病毒的制備：用第5天發(fā)病并麻痹的鼠腦用20%小牛血清磷酸鹽緩沖液研磨稀釋成10-1懸液，經(jīng)2000r/min20分鐘沉淀，取上清混勻后分裝小管，存-70℃冰箱待用。
1.5 病毒懸液的預測
1.5.1凍干病毒的預測：取含20%腦懸液的凍干病毒，啟開后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均勻后再用4.0ml上述稀釋液與病毒液充分混勻，1500r/min沉淀10分鐘，取上清與等量的稀釋液混合則為10-2懸液，然后再用10-3、10-4、10-5、10-6稀釋，從10-6至10-2各取0.5ml加入5個小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小時。用體重10~12g小白鼠30只，分成5組，每組6只，經(jīng)用37℃作用的10-6至10-2病毒懸液接種小白鼠，每個稀釋度接種6只小白鼠，每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml，觀察14天，每天觀察小白鼠發(fā)病死亡情況，接種后4天內(nèi)死亡的小白鼠按非特異性死亡計。以接種5天后的發(fā)病死亡小白鼠統(tǒng)計LD50。
1.5.2-70℃凍存病毒懸液的預測：取含10%腦懸液的冰凍病毒用流水融化后即為10-1懸液，然后再做10-2至10-7稀釋。從10-7至10-3各取0.5ml加至5個小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小時，用體重10～12g小白鼠30只，分成5組，每組6只，用經(jīng)37℃作用的10-7至10-3病毒懸液接種小白鼠，每個稀釋度接種小白鼠6只，每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml，觀察14天，每天觀察小白鼠發(fā)病死亡情況。接種后4天內(nèi)死亡的小白鼠按非特異性死亡計。以接種5天后的發(fā)病死亡小白鼠統(tǒng)計LD50。
1.5.3按以上二種病毒的懸液預測的結(jié)果計算LD50。將用其100個LD50的病毒稀釋度作為中和用病毒懸液稀釋倍數(shù)，用于小白鼠中和試驗。
2 小白鼠的準備
用作中和試驗的bhskgw.cn小白鼠必須是未進行過其他試驗的健康小白鼠，體重為10～12g。
3 中和試驗
3.1狂犬病血清中和試驗用的血清參考標準品：由中國藥品生物制品檢定所提供，或用經(jīng)檢定所認可的各生產(chǎn)單位工作用參考標準品。
3.2待檢定血清樣品的稀釋：取有代表性的血清樣品，按二倍連續(xù)稀釋的方法用2%小牛血清PBS進行稀釋，一般可采用1∶800、1∶1600…1∶102400，但可根據(jù)血清實際效價的情況適當減低或提高試驗時最低稀釋倍數(shù)，如采用上述8個稀釋倍數(shù)，則用待檢血清按2.7ml稀釋液加入0.3ml血清作為1∶10，然后再用3.5ml稀釋液加入混勻的1∶10倍的血清0.5ml為1∶80，再按2.7ml稀釋液加入0.3ml為1∶800。然后均按0.5ml加0.5ml稀釋的方法制成1∶800、1∶1600…1∶1024008個稀釋倍數(shù)，以上8個稀釋倍數(shù)的不同稀釋度分別以0.5ml加入8個小試管內(nèi)待用。
3.3 效價檢定用血清標準品的稀釋：方法同待檢血清樣品的稀釋。如用檢定所的85RS國家標準品，稀釋度應從1∶80開始，其國際單位為26.53/ml。
3.4 中和用病毒懸液的制備：按病毒懸液預測的100個LD50的稀釋度作為中和用病毒懸液。
3.5 中和：將上述3.2項的8個稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管和3.3項的8個稀釋度的各裝0.5ml的8支小試管共16支小試管各加入中和用病毒懸液0.5ml，放置37℃水浴1小時，作注射小白鼠用。另用相同體重的小白鼠測定中和用病毒懸液的實際LD50。其方法可將中和用病毒懸液作為原液再稀釋10-1、10-2、10-3四個稀釋度，以上4個稀釋度各加入0.5ml于小管內(nèi)，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，同樣放置37℃水浴1小時作為中和病毒對照。
3.6接種小白鼠：將已中和的待檢血清和血清標準品的不同稀釋度的懸液和病毒對照接種小白鼠，血清按從濃到稀的倍數(shù)接種小白鼠，而病毒對照則按從稀到濃的倍數(shù)接種小白鼠。每只小白鼠腦內(nèi)接種0.03ml。
3.7 觀察：共觀察14天，每天記錄小白鼠的發(fā)病死亡情況，接種后4天死亡的小白鼠作為非特異性死亡計。
4 待檢血清效價
按下列公式計算：
相對效力=待檢血清ED50的倒數(shù)/血清標準品ED50的倒數(shù)
血清效價（IU/ml)=相對效力×血清標準品的國際單位
