載體（vector)是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。因此，作為載體應(yīng)該滿足以下幾方面的要求：①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；②外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無害，以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段；③有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；④具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。
重組DNA技術(shù)中最常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體λ，柯斯質(zhì)粒（cosmid)和噬菌體M13。它們的受體細(xì)胞都是大腸桿菌。這四種載體的大小和結(jié)構(gòu)盡管各不相同，但它們的共同特點(diǎn)是：①都能在大腸桿菌中自主復(fù)制，而且能連同所帶的外源DNA一起復(fù)制；②都很容易同細(xì)菌DNA分開并加以純化；③都有一段DNA對(duì)于它們自身在細(xì)菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入這一段DNA中，或是置換這一段DNA而不影響載體的復(fù)制。根據(jù)這一特點(diǎn)，載體又可分成插入型和置換型兩大類。
一、質(zhì)粒
質(zhì)粒（plasmid)是許多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子，它是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1kb直到200kb以上。質(zhì)粒所帶的基因通常有利于宿主細(xì)胞。例如基因的產(chǎn)物是某些抗生素或?qū)δ承┛股氐目剐�、能降解某些�?fù)雜的有機(jī)化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素、產(chǎn)生限制酶或修飾酶等。
在天然條件下，許多種質(zhì)粒是通過類似于細(xì)菌接合的過程傳遞給新的宿主。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒則可通過轉(zhuǎn)化過程進(jìn)入受體細(xì)胞。此時(shí)，受體細(xì)胞已經(jīng)過處理而處于感受態(tài)，即它的細(xì)胞暫時(shí)易于讓小的DNA分子透過。受體細(xì)胞由于質(zhì)粒的進(jìn)入而產(chǎn)生了新的表型。如對(duì)某種抗生素的抗性，這樣就可用這種抗生素作為選擇條件，選出被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。醫(yī).學(xué)全.在.線bhskgw.cn
質(zhì)粒復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身染色體的同一組酶系。有些質(zhì)粒處于“嚴(yán)緊控制”之下，即它們的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒。另一些質(zhì)粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質(zhì)粒。每個(gè)細(xì)菌中可以有10～200份拷貝。更重要的是松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可因宿主細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而增加至幾千份。宿主細(xì)胞不合成蛋白質(zhì)時(shí)，染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制都中止。但松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制。因此在增殖松弛型質(zhì)粒時(shí)，總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理（在培養(yǎng)液中加入適量的氯霉素)抑制蛋白質(zhì)的合成。
圖23-3 pBR322的基本結(jié)構(gòu)
�。ㄒ�)大腸桿菌質(zhì)粒
應(yīng)用的最廣泛的質(zhì)粒載體是pBR322，它屬松弛型質(zhì)粒，有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)抗性基因可作為標(biāo)記基因，有許多種常用的限制酶的切點(diǎn)。它全長4352個(gè)核苷酸，排列順序已全部測(cè)定，基本結(jié)構(gòu)如圖23-3。
當(dāng)需要用pBR322來克隆Bam HI酶切的一個(gè)DNA片段時(shí)，一般的做法是如圖23-4所示。
圖23-4 pBR322克隆DNA片段的程序
從圖23-4可見，外源DNA片段同pBR322都經(jīng)Bam HⅠ酶切，所以有相同的單鏈“粘性末端”，通過DNA連接酶可以構(gòu)成重組DNA分子。由于pBR322的Bam HⅠ酶切點(diǎn)在四環(huán)素的抗性基因中，所以Bam HⅠ酶切后使這個(gè)抗性基因失活。如果酶切后的質(zhì)粒pBR322自身又重新連接，則恢復(fù)對(duì)四環(huán)素的抗性，轉(zhuǎn)化子就仍然具有對(duì)二種抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA，則轉(zhuǎn)化子失去了四環(huán)素抗性表型，而只有對(duì)氨芐青霉素的抗性，這樣就可根據(jù)轉(zhuǎn)化子的抗性而把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌選出，然后擴(kuò)增細(xì)菌，大量回收質(zhì)粒DNA，從而達(dá)到大量擴(kuò)增外源DNA的目的。
�。ǘ�)真核生物中的質(zhì)粒
真核生物中的酵母是國內(nèi)外廣泛研究的載體-受體系統(tǒng)之一。這是一個(gè)共價(jià)閉環(huán)DNA分子（cccDNA)，平均周長2μm，所以稱為2μm DNA質(zhì)粒，在每個(gè)酵母細(xì)胞里約有100個(gè)拷貝。已有人把2μm DNA同pBR322 DNA構(gòu)建成雙功能質(zhì)粒，可在大腸桿菌和酵母菌中復(fù)制。這種質(zhì)粒帶有啤酒酵母的二個(gè)基因（his 3和Leu 2)，所以很容易用酵母的營養(yǎng)缺陷型菌株來選出。
