醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:鼻息肉及下鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞中組胺受體的表達(dá)

組胺不僅在細(xì)胞及組織內(nèi)發(fā)揮各種生理作用，而且可引起變應(yīng)性鼻炎.組胺的各種作用是通過(guò)與細(xì)胞表面的組胺受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，到目前為止所了解的組胺受體共有4種，分別為1,2,3,4型［1��2］.不同亞型的組胺受體起著不同的G�猜�(lián)結(jié)蛋白質(zhì)受體的功能,其中人1型組胺受體基因位于3p25染色體上，在胎盤(pán)中可見(jiàn)較多的表達(dá)，在肺、骨骼肌、心臟及腦組織中可見(jiàn)少量的表達(dá)［3��4］.2型組胺受體基因位于13號(hào)染色體上，在胃中有較強(qiáng)的表達(dá)，亦表達(dá)于腦組織及心臟［5］.胃壁細(xì)胞2型組胺受體被刺激時(shí)，可促進(jìn)胃酸的分泌.3型組胺受體位于20號(hào)染色體上，可在丘腦的各個(gè)部位內(nèi)選擇性地表達(dá)［6］，并表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及末梢神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)起調(diào)節(jié)作用［7］.4型組胺受體基因位于18q11染色體上，多表達(dá)于骨髓及脾臟，亦表達(dá)于末梢血液、胸腺、小腸及結(jié)腸［8��9］.目前認(rèn)為4型組胺受體可能是Gi結(jié)合型受體，對(duì)免疫功能的影響及作用機(jī)制尚不十分清楚.成纖維細(xì)胞在人體中維持組織的結(jié)構(gòu)，分泌各種化學(xué)趨化因子如IL��8，CM�睠SF，eotaxin，IL��1,IL��6等［10��14］.上述現(xiàn)象提示，鼻息肉組織成纖維細(xì)胞中可能存在組胺受體，而其在鼻息肉的生成及發(fā)育過(guò)程中可能起著重要的作用.本研究旨在探討鼻息肉組織成纖維細(xì)胞中組胺受體及其亞型的存在與否，觀察鼻息肉組織中組胺受體蛋白的表達(dá)程度.

1  對(duì)象及方法

1.1  對(duì)象  選擇鼻息肉患者5例為研究對(duì)象，并將同側(cè)的下鼻甲黏膜為對(duì)照組.所有患者均有鼻涕及鼻塞等鼻部癥狀，MAST檢查呈陰性，AST及NPT檢查亦呈陰性，排除合并變應(yīng)性鼻炎；所有患者均無(wú)吸煙史及其他疾病.術(shù)前2周內(nèi)禁用激素、抗生素及抗組胺類藥物.

1.2  方法

1.2.1  細(xì)胞培養(yǎng)  行功能性鼻內(nèi)窺鏡手術(shù)，切除鼻息肉及部分下鼻甲黏膜，行組織細(xì)胞培養(yǎng).成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：用含有500U/mL青霉素,500mg/L鏈霉素,6mg/L fungizon(GIBCO,美國(guó))的PBS洗滌3次，將下鼻甲黏膜切成1mm3大小，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下放置5min，使之黏附，再添加含有100g/L FBS的Dulbeco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GIBCO,美國(guó))培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)形成單層成纖維細(xì)胞后除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌，添加0.5g/L胰蛋白酶�睧DTA，置于37℃，50mL/L二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)處理5min，使細(xì)胞分離，用含有20g/L FBS及抗生素的DMEM培養(yǎng)液浮游細(xì)胞，進(jìn)行隔代培養(yǎng)（圖1).將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分別灌注到6孔培養(yǎng)皿中，每孔細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的是2代培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞.

圖1  培養(yǎng)完成后的鼻黏膜成纖維細(xì)胞

1.2.2  RT�睵CR  RNA的分離依照RNA�睟ee溶液的分離方法(Tel�瞭est,Inc,Friendswood,美國(guó))進(jìn)行.在直徑為60mm培養(yǎng)皿里放入1mmol/L RNA�睟ee溶液進(jìn)行溶解，添加0.2倍的氯仿使之混合后置于冰塊上，5min后用離心機(jī)（Centrifuge 5402,Eppendrof,德國(guó))于12000r/min，4℃離心15min，取上清液，加入同等量的isopropanol，在室溫條件下沉淀10min，隨后以12000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，向沉淀物中加入750mL/L乙醇0.8mL，以7500r/min，4℃離心5min，置于空氣內(nèi)10min，使沉淀物在空氣中干燥后分離出ＲＮＡ，將其用ＤＥＰＣ處理過(guò)的蒸餾水溶解.采用熒光分光光度計(jì)(Ultraspec 2000,Parmacia Biotech,Cambridge,英國(guó))于波長(zhǎng)為260nm及280nm處測(cè)定ＲＮＡ值，Ａ２６０／Ａ２８０比值為１.５～１.８，將ＲＮＡ置于-70℃保存.為進(jìn)行酵素聚合連鎖反應(yīng)需合成相補(bǔ)的ＤＮＡ（cDNA).將１μg ＲＮＡ調(diào)節(jié)到用ＤＥＰＣ處理過(guò)的蒸餾水１０μL中，７０℃加熱５min，于冰塊上放置5min.加入２μL的１０×緩沖劑(0.1mol/L Tris�阐}酸, pH值為9.0,0.5mol/L氯化鉀,10g/L Trition X��100),取4μL 25mmol/L氯化鎂， 2μL 10mmol/L dNTP,0.5μL(40U/μL)RNase抑制物,加入15U ＡＭＶ反向transcriptase(Promega,Medison,WI,美國(guó))后將總劑量調(diào)整至２０μL.反應(yīng)條件為４２℃ １h，９５℃ ５min，４℃ ５min.PCR反應(yīng)如下:在２μL cDAN中加入５μL的１０×ＰＣＲ buffer(100mmol/L Tris�阐}酸, pH值為8.3, 0.5mol/L氯化鉀,15mmol/L氯化鎂),4μL的2.5mmol/L dNTP,20pmol上游及下游引物，２U Ｔaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)，滅菌蒸餾水調(diào)整至50μL.利用遺傳因子增幅器（Biometra, Gottingen,德國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增，具體的條件為組胺受體（HR1，HR2，HR3，HR4與β�瞐ctin)初期變性95℃ 5min，95℃ 1min,55℃ 1min，72℃延長(zhǎng)1min，共30個(gè)周期（β�瞐ctin是25周期)，最后的延長(zhǎng)是72℃10min.10μL PCR生成物內(nèi)混合加入2μL的6×載入緩沖液(2.5g/L溴酚藍(lán),2.5g/L二甲苯藍(lán),300g/L蔗糖)，再添加0.5mg/L溴化乙錠，于含0.5×TBE(45mmol/L Tris�瞓orate, 1mmol/L EDTA)的20g/L瓊脂糖凝膠中，以90V電壓下電泳1h，利用Gel Doc 1000凝膠成象系統(tǒng)（Bio�睷ad, Hercules,CA,美國(guó))觀察條帶.1型及2型組胺受體的陽(yáng)性對(duì)照選擇鼻黏膜的上皮細(xì)胞，3型及4型的選擇人末梢血液白細(xì)胞.Real�瞭ime PCR：向1.5mL實(shí)驗(yàn)管內(nèi)加入25mmol/L氯化鎂2.4μL,2μL含Lightcycler fast start enzyme的DNA master SYBR green Ⅰ, 10pmol上游及下游引物，以蒸餾水調(diào)節(jié)為１８μL，向１８μL混合物中加入２μL cDNA后，分別灌注到離心管內(nèi)，于７００r/min條件下離心５min，移至Lightcycler增幅器（Roche Applied Science, Mannheim,美國(guó)).１型及２型組胺受體β�瞐ctin的退火溫度為５５℃，根據(jù)ＰＣＲ生成物的大小將速度調(diào)節(jié)為２５bp/s進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增醫(yī).學(xué).全.在.線bhskgw.cn.

1.2.3  流式細(xì)胞儀檢測(cè)  用ＰＢＳ將已形成單層的成纖維細(xì)胞洗滌2次，37℃條件下用0.5g/L胰蛋白酶�睧DTA處理5min，向細(xì)胞內(nèi)添加100g/L  FBS，收集細(xì)胞，以12000r/min，４℃離心５min，用冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀物２次，添加１型及２型組胺受體的1次抗體（Chemicon,Temecula,CA,美國(guó))稀釋２０倍，在４℃條件下反應(yīng)１h，待反應(yīng)結(jié)束后用冷PBS洗滌２次，用異硫氰酸熒光素結(jié)合抗體(Chemicon, Temecula,CA,美國(guó))稀釋5000倍后，于４℃條件下反應(yīng)1h，用冷PBS洗滌２次，利用ＦＡＣＳ進(jìn)行測(cè)定.在無(wú)刺激條件下培養(yǎng)２４h，測(cè)定１型及２型組胺受體蛋白.

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