 |
2．病原菌的鑒定
通過(guò)分離培養(yǎng)得到的病原菌需要進(jìn)行鑒定，以查明是哪一種細(xì)菌。鑒定的方法包括形態(tài)學(xué)觀察、生化特性試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)。
(1)形態(tài)學(xué)觀察
不同的病原菌在各種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特點(diǎn)是不同的，菌體的形態(tài)和染色反應(yīng)也不完全一致。這些特點(diǎn)對(duì)于細(xì)菌的鑒別很有幫助，應(yīng)仔細(xì)觀察。
菌落的形態(tài)觀察：注意菌落的大小、結(jié)構(gòu)是均勻一致還是呈沙粒狀，表面是光滑濕潤(rùn)還是干燥無(wú)光澤或呈皺紋狀，邊緣是整齊還是不規(guī)則，菌落是隆起、扁平還是呈乳頭樣，是透明還是半透明或不透明，呈什么顏色等；在半固體培養(yǎng)基上細(xì)菌是沿著接種線(xiàn)生長(zhǎng)，還是呈均勻渾濁生長(zhǎng)，或是呈毛刷樣生長(zhǎng)，上下是否生長(zhǎng)一致等；在特定的選擇培養(yǎng)基上是否生長(zhǎng)，長(zhǎng)出的菌落是否與預(yù)期的病原菌相似，在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)是否溶血，溶血環(huán)的bhskgw.cn/shouyi/zhujiage/zhurou/特點(diǎn)如何等。
細(xì)菌的形態(tài)觀察：通過(guò)抹片、染色和鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小和排列規(guī)律，是否產(chǎn)生芽胞、芽胞的位置如何，能不能運(yùn)動(dòng)，有無(wú)莢膜，細(xì)菌的染色反應(yīng)如何。細(xì)菌的染色對(duì)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察占有非常重要的位置，細(xì)菌菌體小而透明，詳細(xì)觀察活體形態(tài)很不容易，通過(guò)染色，形態(tài)特點(diǎn)才清晰可見(jiàn)。此外，各種細(xì)菌對(duì)不同染料的親和力不同，可以用鑒別染色的方法識(shí)別某些細(xì)菌，這對(duì)于細(xì)菌分類(lèi)很有幫助。
(2)生化特性試驗(yàn)
細(xì)菌分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生各種各樣代謝產(chǎn)物。細(xì)菌不同，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，用化學(xué)方法檢查某些代謝產(chǎn)物的存在，來(lái)鑒別和確定某種病原菌。形態(tài)特征相近的菌種，僅憑形態(tài)學(xué)檢查是不容易鑒別的，但通過(guò)檢查它們的代謝產(chǎn)物就可以把它們區(qū)別開(kāi)來(lái)。如沙門(mén)氏菌和大腸桿菌都是腸道菌，形態(tài)、大小、染色特性都相似，鏡檢不能區(qū)別，但它們的生化特性不同，前者不發(fā)酵乳糖，后者發(fā)酵乳糖，用乳糖發(fā)酵方法就可以把這兩種細(xì)菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，生化特性試驗(yàn)是鑒別細(xì)菌必不可少的方法之一。
●糖發(fā)酵試驗(yàn)：有些細(xì)菌能分解糖而產(chǎn)生各種酸，有些細(xì)菌還繼續(xù)分解其中的某些酸而產(chǎn)生氣體(如二氧化碳和氫)，可根據(jù)分解不同的糖類(lèi)來(lái)識(shí)別病原菌。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌種接種于糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)2～3天，如培養(yǎng)基顏色變黃，表示發(fā)酵產(chǎn)酸，用“+”表示；培養(yǎng)基變黃，并有氣泡，用“○”表示；培養(yǎng)基仍為藍(lán)色，無(wú)變化，表示不發(fā)酵。培養(yǎng)基有需氧菌培養(yǎng)基和厭氧菌培養(yǎng)基兩種。
●需氧菌培養(yǎng)基：用鄧亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液 (蛋白胨2克，氯化鈉0．5克，蒸餾水100毫升，pH7．6)按 0．5％～1％的比例加入葡萄糖或其它各種糖，每100毫升加入1．2毫升的0．2％溴麝香草酚藍(lán)(溴麝香草酚藍(lán)0．2克，0．1摩爾／升氫氧化鈉5毫升，加蒸餾水95毫升)，或用1．6％溴甲酚紫酒精溶液0．1毫升作指示劑。分裝于試管(每個(gè)試管事先都加一枚倒立的小發(fā)酵管)，478．8帕(10磅每平方英尺)高壓滅菌10分鐘。如在培養(yǎng)基中加入瓊脂0．5％～0．7％，則成半固體，可省去倒立的小發(fā)酵管。但接種時(shí)應(yīng)穿刺。
●厭氧菌培養(yǎng)基：將20克蛋白胨、5克氯化鈉、1克硫乙醇酸鈉、1克瓊脂和1000毫升蒸餾水放于燒杯內(nèi)，加熱混合溶解，再加入10克所需測(cè)定的糖，調(diào)整到pH7．0，加入指示劑(1．6％溴甲酚紫酒精溶液1毫升)，分裝試管，在478．8帕 (10磅每平方英尺)高壓滅菌15分鐘后，作成高層。將厭氧菌的培養(yǎng)物穿刺接種于此培養(yǎng)基的深部。
●靛基質(zhì)(吲哚)試驗(yàn)：有些細(xì)菌能分解色氨酸而產(chǎn)生靛基質(zhì)，后者與對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈紅色。試驗(yàn)時(shí)將待檢菌接種于鄧亨氏蛋白胨水中，在37℃培養(yǎng) 2～3天就可查出，先加入氯仿2毫升，再加科氏(Kovacs)試劑(對(duì)二甲基氨基苯甲醛5克，戊醇75毫升，濃硫酸25毫升)2毫升于液面上，如出現(xiàn)紅色環(huán)，表示陽(yáng)性反應(yīng)。有的則需要每天檢查，一直觀察到6—7天。
也可以用草酸測(cè)定。取一濾紙條，在草酸飽和溶液中浸濕，晾干后，懸掛在培養(yǎng)液上面，在37℃培養(yǎng)。若濾紙變紅，表示培養(yǎng)物產(chǎn)生吲哚。
●維培(V-P)二氏試驗(yàn)：在有蛋白胨存在的情況下，有些細(xì)菌分解葡萄糖而產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，在堿性條件下氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，產(chǎn)生粉紅色化合物。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌接種于通用培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)2天，加入與培養(yǎng)物等量的O"Meara"s試劑(加有0．3％肌酐的40％氫氧化鉀水溶液)，猛烈搖振混合。強(qiáng)陽(yáng)性者約于5分鐘后，在培養(yǎng)基表面的下層出現(xiàn)紅色反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間無(wú)反應(yīng)，置室溫過(guò)夜，次日不變者為陰性。此種試驗(yàn)常用來(lái)鑒定產(chǎn)氣桿菌和大腸桿菌，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。
通用培養(yǎng)基
蛋白胨 5．0克
磷酸氫二鉀 5．0克
葡萄糖 5．0克
蒸餾水 1000毫升
將各種成分溶于1000毫升的水中，調(diào)至pH7．0，分裝試管內(nèi)，間歇滅菌或478．8帕(10磅每平方英尺)10分鐘滅菌。
●甲基紅(MR)試驗(yàn)：有些細(xì)菌分解葡萄糖，產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)較多，使培養(yǎng)基變酸(pH4．5以下)。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基與V-P氏試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基相同。按種被檢菌于培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，加入0．02％甲基紅酒精溶液數(shù)滴，若呈紅色，為陽(yáng)性反應(yīng)。此種試驗(yàn)也常用來(lái)鑒別產(chǎn)氣桿菌和大腸桿菌，前者為陰性，后者為陽(yáng)性。
●檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：有些細(xì)菌把檸檬酸鹽做為碳原子的唯一來(lái)源。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌接種于檸檬酸鈉培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)2～4天后利用檸檬酸鈉的細(xì)菌表現(xiàn)為有細(xì)菌生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基變藍(lán)；不利用的細(xì)菌不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。此培養(yǎng)基也可用來(lái)鑒別產(chǎn)氣桿菌和大腸桿菌，前者能生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變堿，指示劑變藍(lán)，后者不能生長(zhǎng)。有些沙門(mén)氏菌特別是鼠傷寒沙門(mén)氏菌也能生長(zhǎng)，但傷寒桿菌和副傷寒桿菌則不能。
Simmons檸檬酸鹽培養(yǎng)基
檸檬酸鈉 1．0克
硫酸鎂 0．2克
氯化鈉 5．0克
磷酸二氫銨 1．0克
磷酸氫二鉀 1．0克
1％溴麝香草酚藍(lán)酒精溶液 10毫升
瓊脂(精制) 20．0克
蒸餾水加至 1000毫升
調(diào)pH至6．8，718．2帕(15磅每平方英尺)15分鐘高壓滅菌后作成斜面。將上述培養(yǎng)基中的瓊脂省去，則成液體培養(yǎng)基，同樣可以應(yīng)用，接種、培養(yǎng)、觀察同上。
●硝酸鹽還原試驗(yàn)：有些細(xì)菌能把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24～48小時(shí)，加入下列試劑：
試劑甲
對(duì)氨基苯磺酸 0．4克
試劑乙
2－萘胺 0．25克
5摩爾／升冰醋酸 50毫升
每管先加試劑甲0．1毫升，再加試劑乙數(shù)滴，如發(fā)生紅色說(shuō)明硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。有些細(xì)菌還能繼續(xù)把亞硝酸鹽分解成氨和氮，這時(shí)加入試劑不會(huì)變紅。但產(chǎn)生的氮可在培養(yǎng)基中置一倒立的小試管而收集到。
硝酸鹽培養(yǎng)基
蛋白胨 5．0克
硝酸鉀(化學(xué)純) 0．2克
蒸餾水 1000毫升
將各種成分溶于1000毫升的水中調(diào)節(jié)pH至7．4，分裝試管，每管約5毫升，718．2帕(15磅每平方英尺)高壓滅菌15分鐘。
●硫化氫試驗(yàn)：有些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，其產(chǎn)生的硫化氫會(huì)使培養(yǎng)基中的醋酸鉛或三氯化鐵，形成黑色的硫化鉛或硫化鐵。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌接種于醋酸鉛瓊脂斜面上，并沿管壁穿刺至底部。在37℃下培養(yǎng)1～2天后觀察，必要時(shí)可延長(zhǎng)5～7天。若產(chǎn)生硫化氫斜面和底部將變黑；也可將細(xì)菌接種在普通瓊脂斜面上，在棉塞和試管之間夾入一條事先在醋酸鉛飽和溶液中浸泡并晾干的濾紙條，使濾紙懸掛在斜面的上方。培養(yǎng)后若濾紙條發(fā)黑，表明產(chǎn)生了硫化氫。
醋酸鉛瓊脂培養(yǎng)基
高壓滅菌的肉湯瓊脂 100毫升
高壓滅菌的10％的硫代硫酸鈉溶液(新配) 2．5毫升
高壓滅菌的10％醋酸鉛溶液 3毫升
在融化的瓊脂內(nèi)加入硫代硫酸鈉溶液，待涼至60℃，再加入醋酸鉛溶液，混合均勻，無(wú)菌分裝滅菌試管達(dá)三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成瓊脂高層。
●明膠液化試驗(yàn)：有些細(xì)菌能液化明膠。試驗(yàn)時(shí)用接種環(huán)將被檢菌穿刺接種于營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基中直至試管底部，在20～ 25C下培養(yǎng)。在此溫度中明膠是凝固的，若發(fā)生融化，液化部分呈液體狀態(tài)，將試管傾斜即可看出。
營(yíng)養(yǎng)明膠
肉湯培養(yǎng)基 1000毫升
明膠 120～150克
將明膠加入肉湯培養(yǎng)基中，加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH至7．4～ 7．6，用棉花紗布過(guò)濾，分裝試管，718．2帕(約15磅每平方英尺)高壓滅菌15分鐘，取出直立凝固，不擺斜面。
●尿素酶試驗(yàn)：有些細(xì)菌產(chǎn)生尿素酶，能分解尿素。試驗(yàn)時(shí)將被檢菌接種于尿素培養(yǎng)基斜面上，同時(shí)作劃線(xiàn)及穿刺，置 37℃培養(yǎng)24小時(shí)后觀察，培養(yǎng)基從黃色變紅色時(shí)為陽(yáng)性。接種量多，反應(yīng)快的細(xì)菌，數(shù)小時(shí)即可使培養(yǎng)基變紅。陰性者應(yīng)繼續(xù)觀察達(dá)4天。
尿素酶培養(yǎng)基
蛋白胨 1．0克
葡萄糖 1．0克
氯化鈉 5．0克
尿素 20．0克
磷酸二氫鉀 2．0克
0．2％酚紅溶液
