實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　染色方法

一、本科標抗體法

酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連結在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。

（一)酶的種類及特點

從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多�，F(xiàn)將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。

表4-1 免疫細胞化學常用的酶

Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產物沉淀必須穩(wěn)定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應穩(wěn)定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應改變，且酶的催化活性（Turnover)越高越好；⑤酶標過程中，酶與抗體連結，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。

其中，①②兩點甚為重要，因為并非容易顯示的酶均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP)較佳，是最常用的一種酶。HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山崳菜)的葉內含量最豐富而得名。它是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合組成的一種糖蛋白，糖占16%～18（8條糖鏈分布在HRP分子表面)，分子量40kD，最適pH5～5.5，最適溫度40～45℃； pH4～11，50℃以下均較穩(wěn)定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，最大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值（Od 403/275)衡量，Reinheit Zahl (RZ)bhskgw.cn/shiti/表示。一般認為，標記酶的RZ值為3.0左右，不應小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，例如RZ值為0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高達75%。對于純度低、質量差的酶，需純化后使用。

除HRP外，堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD)也較常用。ALP分子量約為HRP的2～3倍，最適pH9.0～9.5左右，比較穩(wěn)定，內源性ALP也較易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole,分子量240.8kD)抑制，但腸粘膜表面的內源性ALP活性不受影響。目前所用的ALP大多系由牛的腸粘膜提取制得，所以腸粘膜等呈強陽性反應。

ALP最初是由Bulman等用于標記抗體的。選用不同的底物，可形成不同顏色的終產物，例如以萘酚（As-Mx)和快藍（Fast Blue, FB)為底物，生成藍色沉淀。用快紅（Fast Red, FR)代替FB，形成紅色不溶沉淀。與HRP/4-氯-1-萘酚（CN)或DAB形成的沉淀形成鮮明對比，但FB、FR等沉淀物溶于有機溶劑，不能進行脫水、透明等處理。據報告，利用新品紅（New fuch－sine )顯色，形成的紅色沉淀產物不溶于有機溶劑，不褪色，輕度核復染后，可制成半永久性保存標本。

GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍（P-Nitroblue Tetrazolium),終產物為不溶性的藍色沉淀，比較穩(wěn)定。從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術。

（二)本科標抗體的制備（Boosma,DM, 1983)

酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)劑的作用，將酶連結在抗體分子上。偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個基本特征：①偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結，必須是不可逆的，即借共價鍵連結；②偶聯(lián)劑不應影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結合。

在HRP標記抗體中，常用的偶聯(lián)劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等，現(xiàn)簡介如下。

1．戊二 醛標記法戊二醛為制備各種酶標抗體最常用的偶聯(lián)劑。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯釋及戊二醛自身聚合本等雜質，故需純化后使用。戊二醛的純度用含雜質的二醛的單體戊二醛的OD比值表示，它們的最大吸收光波長分別為235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280)小于3時，制備酶標抗體的效果較好，大于3時，需經蒸餾或Sephadex G-10柱層析或活性碳吸附等處理，除去雜質后應用。其制備方法分一步法和兩步法；基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結合，將酶連結于抗體上。

（1)一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經透析除去標記物中剩余的戊二醛，制得酶標抗體。優(yōu)點是簡單省時，缺點是反應程度不易被控制，因為酶蛋白分子和抗體蛋白分子同戊二醛間的反應速率不同，抗體蛋白的氨基數(shù)遠較HRP為多，與戊二醛反應快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內和分子間的彼此交聯(lián)，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯(lián)相應減少，影響酶的標記。據Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結，標記率較低（約1%～5%)很難獲得理想的酶標抗體。

（2)二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應（HRP：戊二醛為1：105)，以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結合，另一個醛基游離；然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛復合物)，再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結合，制成酶標抗體。過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結，避免酶本身聚合。根據所用的HRP與抗體（IgG)比例不同，酶標記率各異，平均為5%～25%。標記步驟如下：

①10～15mgHRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸緩沖液配制)，18h室溫。

②透析或 SephadexG-25柱層析（0.15mol/l NaCl平衡)，去除過量的戊二醛，收集活化HRP。

③濃縮活化HRP至10mg/ml左右，加入抗體5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸鹽緩沖液（pH9.5)調整pH至9.0～9.5,使抗體與活化HRP結合，4℃24h。

⑤加入0.1ml賴氨酸緩沖液，阻斷未反應的醛基，4℃，2h。

⑥用半飽和硫酸銨沉淀5次，對PBS透析24h，4℃，換3次PBS，除去硫酸銨（10000rpm/min,30min)。

⑦或用凝膠色譜法（SephadexG-200/Sephacryl S-200) 等分離標記抗體。

注意：該方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游離氨基較少，與戊二醛反應后，制成的酶標抗體大部分為單體；而RZ值小于2.8的HRP，含有較多的游離氨基，與戊二醛反應后，易形成多聚體，使方法的敏感性下降。

2．過碘酸鹽氧化法嚴格地講，過碘酸鈉（Sudium periodate)不是一種真正的偶聯(lián)劑，其本身并非作為橋連結在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶（如HRP)的標記。我們知道，HRP分子的糖本身與酶活性無關，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應，生成Shiff’s堿。此Shiff’堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經氫硼化鈉（NaBH4)還原，形成穩(wěn)定的酶標抗體復合物（圖4-1)。為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯(lián)，預先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene)處理HRP，阻斷分子內的ε-、α-氨基。

圖4-1　過碘酸鹽氧化原理

過碘酸鹽氧化法，酶的RZ值≥3時較佳；RZ<3時，糖含量較少，游離氨基較多，氧化時酶易發(fā)生本身聚合，影響酶標抗體的產量，據報告，適當?shù)乜刂七^碘酸鹽溶液及反應條件，幾乎所加入的HRP和抗體均形成酶標抗體，其標記率為70%左右。具體步驟為：

（1)4mgHRP(RZ=3.0)溶于1.0ml雙蒸水中。

（2)加0.2ml新鮮配制的0.1mol/LNaIO4，輕輕搖動混合20min,肉眼可見液體內棕黃變成深綠色。

（3)對0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.4)透析，20h，4℃。

（4)調整HRP液體的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.5),立即加入抗體(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸鹽緩沖液溶解),輕輕混勻后,置室溫2h。PH≤8.5時,抗體的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能與CHO基反應,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。

（5)加入0.1ml新鮮配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以穩(wěn)定酶標抗體復合物。

（6)經透析等去除未反應的NaBH4，避免還原過度。然后經鹽析或柱層析等方法分離酶標抗體（方法同戊二醛法)。

如此制得的酶標抗體，加入終濃度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA)分裝后于-80℃可保存數(shù)年；亦可加入6%等量甘油，混勻置-20℃/4℃保存1年左右。上述兩種標記法是ICC研究中最常用的酶標抗體制備方法。

3．Maleinmide法上述酶標抗體（IgG)的分子量較大，對抗體的穿透性有一定影響，而在制備過程中，需經兩次純化，即多聚體與單體及單體與非標記抗體的分離。已知單體（1個HRP分子標記1個IgG分子)的分子量為190～200kD，非標記抗體為146～150kD，用凝膠過濾法很難將二者分開。所以,Sternberger等進行了抗體片段Fab的標記。用植物性蛋白酶---木瓜酶（Papain)水解抗體蛋白，可獲得一個無抗體活性穩(wěn)定的Fc段結晶和兩個相同的抗原結合片段（Fab)，此Fab段為單價，分子量50kD,HRP標記后，單體分子量為90kD,較容易將單體和非標記的Fab段分離。在此基礎上，Imagawa(1982)又進行了改良，引入了N-羥基丁二酰酯（Maleinmide)，標記抗體的特定部位---Maleinmide法。該方法的主要原理是：（1)借助雙功能試劑Maleinmide活化HRP，使其具有與—Hs 基反應的能力；（2)利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重鏈在近羧基端被切斷，這樣在絞鏈區(qū)（Hinge region)至少可以保留一個S-S鍵，從而得到一個具有雙價抗體活性的F（ab＇)2段。該S-S鍵與抗體活性無關�？梢酝ㄟ^加入硫基乙醇（2（β)-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH)使其斷裂，被還原成—HS基 。如此雙價抗體活性的F（ab＇)2片段即變?yōu)閹в小狧s 基的單價Fab’片段，后者再與活化的HRP結合，便制成了酶標抗體Fab＇。由于空間遮蔽的關系，絞鏈區(qū)即使存在兩個—HS基，也只能有一個能與酶結合，另一個—HS基不能與酶反應，即酶與抗體Fab’段結合比例為1：1，因此酶標抗體Fab’段絕大多數(shù)是單體，很少形成多聚體。在標記過程中，應用過量的活化HRP，還能避免非標記抗體Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量與Fab段相似（50kD左右)，所以酶標后Fab＇亦較容易與未標記的Fab＇分離。此標記方法多用于酶免疫分析研究，其步驟為：

①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。

②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide)中。

③將上述兩種液體充分混合，持續(xù)攪拌1h,30℃。

④離心取上清，經0.1mol/lPB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱層析，收集含有蛋白部分的洗脫液，濃縮，制得活化HRP。

⑤每1.8mg活化HRP，加入已被還原的Fab＇2mg,4℃20h持續(xù)攪拌。

⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200分離酶標抗體Fab＇片段，保存同前。

（三)酶標抗體的純化

上述各種方法制備酶標抗體時，除產生酶標抗體外，還有未標記的抗體蛋白、游離酶、酶二聚體及偶聯(lián)劑等。這些均可使酶標抗體的敏感性下降，故酶標抗體須經純化后應用�，F(xiàn)簡介幾種常用的純化方法。

1．多聚體的分離實驗中，不同的試劑形成的多聚體的數(shù)量各異，即使同樣的實驗藥物和程序，在不同的時間制備的酶標抗體中，多聚體的數(shù)量亦不相同。多聚體較單體含酶量多，與組織的非特異吸附增強，使方法的敏感性下降，故用前必須除去多聚體。以凝膠過濾法分離多聚體的效果較好。

2．非標記抗體的分離 非標記抗體與標記抗體具有相同的免疫學特征，能競爭與組織特異抗原結合，而且親和力較標記抗體強，優(yōu)先與組織抗原結合。一般認為每個抗體連結1～2個酶分子，并不影響抗體的兩個（Fab)抗原結合點，但因存在空間遮蔽現(xiàn)象，一個Fab段與組織特異性抗原結合。非標記抗體則不存在這種現(xiàn)象，兩個Fab段均與抗原結合，因而親合力較強。所以酶標抗體在應用前須用瓊脂糖親合層析等方法去除非標記抗體。

3．親合層析 　利用蛋白A（Protein A)/瓊脂糖-刀豆素A/瓊脂糖親合層析柱能制得較純的酶標抗體。因為蛋白A與抗體（標記和未標記)間有較強的親合力，不與HRP結合。而刀豆素A與HRP（標記和游離)間的親合力非常強，不與抗體結合。據此二者并用，能獲得較純的HRP酶標抗體。該方法省時，分離能力強（約為凝膠層析的600倍)。但有一定的局限性，因為蛋白A并非與所有種屬的免疫球蛋白親合力均較強，例：不能與羊的免疫球蛋白結合，所以難以用于純化羊的酶標抗體。而刀豆素A與HRP的親合力極強，甚至呈不可逆性結合，可使部分酶標抗體的活性喪失。

（四)染色原理及步驟

1．基本原理酶標抗體與熒光色素標記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標記在每一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。間接法所用的第一抗體是對組織細胞內某種抗原的特異性抗體（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備)；第二抗體則為第一抗體（家兔/小鼠的IgG)的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。

2．染色程序

（1)切片準備：見第一章　。

①石蠟切片經二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫干燥2h以上。

（2)未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，簡而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽（室溫)，風干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據需要可進行組織抗原的激活。

（3)用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時也能節(jié)　省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風干。石蠟切片（滴少量PBS，以防其干燥)直接進行步驟（6)。

（4)切片經PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應用ALP標記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。

（5)根據需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min（室溫)，封閉內源性過氧化酶的活性。應用ALP標記抗體時，此步可省略。

（6)PBS漂洗2min（共兩次)，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室溫)。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內抗原的顯示。

（7)4%BlockAce或0.1%～1%BSA濕盒內孵育15～25min（室溫)，然后；輕輕棄去孵育液（不沖洗)；以阻斷組織與抗體的非特異性結合，降低背景染色。

（8)根據需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20min（室溫，以酶標抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動物免疫前的血清)。或者省略此步，而在稀釋酶標抗體時，加入1%～2%的同一種屬正常血清。

（9)輕輕棄去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀釋的第一抗體（抗體用量：每張切片一般為50～80μl)，濕盒內孵育1～2h（20～25℃)；免疫電鏡用標本，4℃過夜。

（10)PBS充分沖洗（3次×2min)，以去除切片上非特異吸附的抗體。應用不同的第一抗體或同時進行對照標本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。

（11)經0.05%Tween-20/PBs2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標記的第二抗體,濕盒內孵育45～60min(20～25℃)。

（12)PBS漂洗（3次×2min),此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標抗體孵育。

（13)未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室溫)此時輕微固定，既不影響抗原抗體結合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。

（14)呈色：HRP標記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片經PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內10～15min（室溫、暗處)，亦可鏡下控制顯色速度。終產物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標本，呈色3～5min即可，防止DAB終產物向周圍擴散，影響超微結構定位。另外，顯色液應于用前新鮮配制，避免DAB本身氧化變質。新配制的DAB為無色透明液體。若DAB液已氧化變?yōu)樽霞t色，應換新藥重新配制。

（15)將切片置流水中（僅光鏡觀察)或PBS（電鏡標本)內，終止呈色反應。

（16)未固定的冰凍切片，可用1%戊二醛-PBS液加強固定5～10min（室溫)，流水沖洗。

（17)細胞核輕度染色，以甲基綠和蘇木精為常用。前者細胞核呈綠色，與HRP/ALP等終產物對比度尤佳，但不適于微波照射的標本。蘇木精是組織學、病理學研究中普遍應用的核染色方法，與HRP、ALP的終產物對比度比較好。

（18)DAB呈色的標本，可以系列酒精脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物質呈色的標本，在有機溶劑中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固劑如明膠甘油等封固，次日，于蓋玻片周圍涂少許女士用指甲油，可使切片保存時間更長。

（19)鏡檢、觀察記錄同一般形態(tài)學研究。

（20)免疫電鏡用標本，經OSO4后固定，按電鏡標本要求處理（參見本書第七章　)。亦可OSO4固定，噴碳（Carbon Coating),利用掃描電鏡觀察抗原的存在部位。

3．酶標抗體及發(fā)色劑的選擇

HRP特異底物為H2O2,在分解H2O2過程中,與H2O2形成復合物,無電子供體存在時,反應不再進行,當電子供體存在時,迅速生成水,酶被還原,電子供體被氧化環(huán)化,形成苯乙胼聚合體(圖4-2)。在酶反應部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。

圖4-2 DAB反應產物形成過程

HRP催化的酶促反應第一步是特異性的—酶催化底物H2O2，其余反應是非特異的，可用各種電子供體介導，所以選用不同的電子供體，可使終產物呈不同顏色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol)為藍黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine )為深藍色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole)為紅色。市售試劑盒所配顯色液以AEC居多，室溫下較穩(wěn)定，但不能進行脫水等處理，且時間長易褪色。DAB是廣泛應用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明、半永久保存，且終產物具有嗜餓性，經O2O4處理，電子密度增加，適于電鏡下確定抗原的存在部位。但是DAB被認為可能具有致癌性，所以應盡量減少吸入和接觸次數(shù)，最好將DAB制成10倍貯存bhskgw.cn/kuaiji/液，分裝于-20℃保存，應用時稀釋、過濾。與DAB比較，CN敏感性略差，但因其終產物較局限，很少彌散，光鏡觀察較為適合。

（2)ALP，是以As-Mx為底物，F(xiàn)B/FR為發(fā)色團，生成藍色/紅色不溶性沉淀。ALP標記抗體主要用于內源性過氧化酶含量較高的血細胞、淋巴細胞等的ICC染色。顯色液內加入終濃度為2～4mmol/l的levamisole, 大多數(shù)內源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole)以每毫升60～120mmol/L濃度的貯存液-20℃冰箱保存。應用時稀釋30倍。為避免反復稱取，試劑吸水，As-Mx、FR、FB試劑均應小量分裝后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制內源性堿性磷酸酶活性。例如：以每次所用顯色液30ml計算，分裝As-Mx 5～7mg/支、Fr8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀釋30倍，過濾顯色。FR、FB等在光照射條件下易引起沉淀，故顯色反應在暗處進行。

（3)GOD，是以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate)0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成藍色不溶性沉淀。該終產物不溶于有機溶劑，切片可脫水透明，長期保存。但GOD的敏感度較HRP和ALP為低，電子供體少，應用較局限，主要用于兩種酶的放大技術，能提高方法和敏感性和特異性。即用GOD和HRP分別標記第二、第三抗體（例第一抗體為小鼠單克隆抗體、第二抗體為GOD標記的兔抗鼠IgG，第三抗體則為HRP標記的羊抗兔IgG)，ICC染色，以葡萄糖-DAB作顯色劑。基本原理如（圖4-3)。在這里HRP是作為第二酶系統(tǒng)，利用葡萄糖氧化時生成的H2O2作底物，催化酶促反應，不受內源性過氧化酶的影響。而且GOD和HRP所標記的抗體是結合在同一抗原位置，所以能良好地顯示組織抗原的存在。其主要染色步驟為：

①切片經第一抗的孵育；②漂洗，GOD標記的第二抗體孵育40～60min（室溫)；③漂洗，HRP標記的第三抗體孵育30～45min（室溫)；④漂洗，顯色、脫水透明觀察同前。

圖4-3　兩步酶催化反應原理

二、非標記抗體酶法

由于酶標抗體存在一些缺點，例如①酶與抗體間的共價連結可損害部分抗體和酶的活性；②抗血清中的非特異性抗體被酶標記后，與組織成分結合，可致背景染色等。為此Sternberger等在酶標法的基礎上，發(fā)展了非標記抗體酶法。包括酶橋法（Enzyme Bridge Method)和過氧化物酶抗過氧化物酶法（PeroxidaseAntiperoxidase Method, PAP法)�，F(xiàn)分述如下。

（一)酶橋法

1．基本原理首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體，然后使用第二抗體作橋，將抗酶抗體連結在與組織抗原結合的第一抗體上，再將酶結合在抗酶抗體，經呈色顯示抗原的分布。在此過程中，任何抗體均未被酶標記，酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結合，避免了共價連結對抗體和酶活性的損害，提高方法的敏感性，且能節(jié)　省第一抗體的用量。

2．染色步驟 主要程序如圖4-4

圖4-4　酶橋法主要染色步驟

（1)切片準備及第一抗體孵育前處理同間接法，第一抗體（假設來自種屬A)孵育24h（4℃)。第一抗體的稀釋度可高些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結合，較牢固，漂洗時不易丟失。

（2)切片與第二抗體（也稱橋抗體，抗種屬a IgG抗體)孵育1～1.5h（室溫)。應用過量的橋抗體能保證一個Fab段與第一抗體結合，另一個Fab段游離。

（3)切片與抗酶抗體（來自種屬A)孵育1～1.5h（室溫)。因抗酶抗體和第一抗體均系種屬a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結合，起到橋的作用，將抗酶抗體連結在與組織抗原結合的第一抗體上。

（4)切片與酶（HRp70～100μg/ml,PBS溶解)孵育0.5h（室溫)，酶與抗酶抗體結合。

（5)顯色等與酶標抗體法相同。

酶橋法克服了酶標抗體法的缺點，較好地保護了抗體和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗體血清中，含有低親合力和高親合力兩類抗體，它們作為抗原與橋抗體結合，主要依賴于橋抗體對它的親合力，而與其本身對酶的親合力無關，故二者均可被連結在橋抗體上。低親合力的抗酶抗體與酶結合較弱，漂洗時易解離，使大部分酶（70%左右)丟失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結合，但不能與酶結合，影響組織抗原的顯示。為此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，現(xiàn)為ICC研究中常用的方法之一。

（二)PAP法

1．PAP的制備及特征　PAP復合物是離體制備的HRP抗HRP復合物，它的制備方法較多，現(xiàn)簡介其中之一。

（1)制備抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上)，可先于足跖皮下注射滅活的卡介苗（共10mg)，2周后重復1次，刺激機體免疫系統(tǒng)功能，1周后于背部脊柱兩旁皮內多點注射1.0ml乳劑[（福氏完全佐劑，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];間隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐劑1.0mg；再間隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理鹽水中)，分別于前后小腿皮下和背部肌肉內多點注射，1周后采靜脈血，檢查效價。再隔1周第4次加強注射（條件同第3次)，一周后檢查抗體效價，瓊脂糖擴散法（HRP0.1mg/ml)為1：128以上時，頸動脈取血，制備血清低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

（2)制備PAP復合物：離體條件下，使兔抗HRP抗體與HRP形成可溶性復合物。在制備抗HRP血清時，HRP的純度要高（RZ≥3)，而制備PAP復合物時，HRP的質量要求不高，甚至可用酶的粗制品。

【步驟】

①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml)的水溶液。

②混勻，室溫1h后，離心16000g 4℃15min。

③0.9% NaCl(冷鹽水)溶解沉淀，離心16000g 4℃15min，重復4次。

④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg)，室溫，持續(xù)攪拌。

⑤用1N HCl及0.1N HCl調pH至2.3，沉淀物全部溶解變清，立即用1N 及0.1n NaOH調pH至7.2。

⑥慢慢加等體積的飽和硫酸銨，置0℃45min。

⑦離心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸銨漂洗兩次。

⑧用10.50ml水溶解沉淀，對透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L)透析，4℃離心，收集上清，加透析液使體積至10.50ml，分裝低溫保存。

【質量鑒定】

制備的PAP復合物應檢測酶和抗體的含量，以鑒定PAP復合物的質量。常用分光光度計檢測PAP的復合物在280nm（IgG的最大吸收波長)和400nm（HRP的最大吸收波長)的光密度值（OD值)，按下式計算IgG和HRP的含量：

一般HRP/抗HRP的克分子比達1.9時，可分裝冷藏于-85℃冰箱，據報告如此冷藏的PAP復合物可保留14年之久，活性無改變。但稀釋后的PAP復合物不穩(wěn)定，4℃可保存2～3周。最好臨用前配制。

【PAP復合物的特征】

PAP復合物的形成不同于其它抗原抗體反應，在抗原稍過量時，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數(shù)抗原抗體反應需要抗原絕對過量才能形成可溶性復合物。PAP復合物的形狀相當穩(wěn)定，不受抗原量的影響，無論最初加入的抗原抗體過量與否，最終形成的PAP復合物其HRP/抗HRP之比絕大部分為3：2。應用離心沉降、液相擴散等方法分析表明：PAP復合物沉降系數(shù)為11.5s,分子量為400～430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成，呈五角形結構，3個角為HRP，另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2-DAB染色，電鏡下已經觀察到PAP復合物五角形環(huán)狀結構，直徑平均21nm 。這種結構異常穩(wěn)定。據報告PAP復合物的抗HRP抗體與HRP結合常數(shù)為108，在此可溶性復合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩(wěn)定性。

2．PAP染色原理及步驟

（1)原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結在與組織抗原結合的第一抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3、4合并為1，用PAP復合物代替，即第三步用PAP復合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復合物中的抗HRP抗體和第一抗體為相同種屬動物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復合物連結在第一抗體上。

（2)染色步驟：主要步驟與酶橋法相似，如圖4-5。

①切片準備及第一抗體孵育前處理同間接法；切片與特異性第一抗體孵育同酶橋法。

②用過量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。

圖4-5　PAP法主要染色步驟

③用離體制得的PAP復合物（1：30～300稀釋)孵育1～1.5h（室溫)，使其被橋抗體連結在第一抗體上。亦可用ALP抗ALP復合物代替。

④顯色觀察等同間接法。

3．PAP法的評價PAP法應用比較廣泛，特別是近幾年，PAP、ABC等試劑盒商品化，在科研和臨床病理診斷等中有著廣闊的前景。其主要特征和注意事項如下：

（1)抗體活性高：非標記抗體酶法最大限度地保存了抗體活性，因為在所有的反應過程中，任何抗體均未被酶連結，避免了標記過程（共價鍵連結)對抗體活性的損害。

（2)靈敏度高：靈敏度是指ICC方法所能發(fā)現(xiàn)最少數(shù)量抗原而言。從理論上講，PAP法應該較間接法敏感2倍以上，因為酶標抗體法中，酶與抗體為1：1標記，而PAP復合物含有3個HRP分子。假設一個第一抗體同一個酶標抗體/PAP復合物結合，則被連結于抗原部位的酶分子數(shù)量不同，所以PAP法應較敏感。我們知道組織切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上檢測方法的敏感度；但可以假設相鄰切片抗原濃度相對恒定，采用相鄰切片染色，以產生特異性染色所用的第一抗體最低濃度作為方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N)表示。據此，Sternberger(1979)認為PAP法較間接法敏感20～25倍，可進一步稀釋第一抗體，以節(jié)　省其用量。但實際上PAP法與間接法之間的差異并非如此明顯。筆者在實驗中注意到，PAP顯示陽性的抗原，相同的稀釋倍數(shù)的第一抗體在間接法中亦呈陽性反應，而時間陰性時，PAP法亦為陰性。其原因尚不清楚，可能與橋抗體和第一抗體結合時，“剩余”（游離)的Fab段少，PAP復合物被連結的相應減少有關。另外，PAP復合物分子量較大（400KD),冰凍切片時，對組織穿透性遠不如酶標抗體（分子量90～180kDa)，所以不適于免疫電鏡的標本制作。

（3)背景染色低：在酶標抗體法中，被標記的非特異性抗體可與組織成分結合，造成背景染色（圖4-6)。從理論上講，在非標記抗體法，連結抗體中，即使存著非特異性抗體，因其不是抗第一抗體種屬IgG的特異性抗體，故亦不能與抗HRP抗體結合，不能把PAP復合物連結在此非特異性抗體上（圖4-7)。當然，PAP復合物內也可能存在些非抗HRP的抗體，假如這部分抗體能夠與橋抗體及組織成分結合，但因其不是抗HRP的抗體，故不能與HRP結合，無酶活性。因此說橋抗體的引入，使ICC的特異性得到了雙重放大，S/N增大。但也有人認為，過量的橋抗體及PAP復合物等均易與Fc受體結合，致使背景染色增強。實驗表明：合適的切片準備、恰當?shù)貞�用封閉性阻斷劑、正常血清以阻斷非特異性結合，加之適當?shù)剡x擇抗體稀釋度和抑制內源性酶活性，PAP法和間接法二者的背景均相當?shù)汀?/p>

圖4-6　間接酶標抗體法

背景染色增高原因

圖4-7　PAP法降低背景的原理

（4)假陰性及其處理：應用PAP法顯示抗原含理較多的組織或冰凍切片組織抗原保持良好的標本時，可導致陰性結果，這種現(xiàn)象稱為假陰性。Vandesand發(fā)現(xiàn)：應用PAP法顯示大鼠視上核和室旁核內加壓素神經細胞分布時，第一抗體（1：200)染色，加壓素含有細胞呈強性。如果取材前24～48h，腦室內注射秋水仙素，阻斷軸突運輸以增加視上核和視旁核加壓素含量，同時組織標本經脫水、透明、再水化等處理以增加抗體的通透性，同樣稀釋度染色，結果卻陰性。進一步實驗發(fā)現(xiàn)：增加抗體的稀釋度，開始出現(xiàn)陽性染色，稀釋至1：1500時，染色最強，繼續(xù)增加抗體稀釋度，染色強度則下降。Bigbee（1977)認為假陰性是第一抗體用量過高與組織抗原結合過多，使相鄰兩個伉體的Fc段間的距離（d)恰好是連結抗體的兩個Fab段與之結合的長度，于是連結抗體不存在游離Fab段，僅剩無活性的Fc段，所以不能將PAP復合物連結在與組織抗原結合的第一抗體上，結果陰性（圖4-8)。因此，借助PAP法研究組織抗原分布，特別是新鮮組織冰凍切片組織抗原保存較好時，第一抗體盡量用高稀釋度，避免假陰性。石蠟切片很少發(fā)生這種現(xiàn)象，所以PAP法在石蠟切片的ICC觀察中更為常用。

圖4-8　示假陰性：組織切片上結合過多的第一抗體，兩抗體間的距離d 恰好適于橋抗體的兩個Fab段與之結合，無PAP復合物結合的位置

（5)橋抗體：也稱連結抗體，它的兩個Fab段具有相同的結構、性質及與抗原結合的能力。因此，當?shù)谝豢贵w和PAP復合物中抗HRP抗體來自同一種屬動物時，橋抗體能同時與上述兩種抗體結合，起到橋的作用。為了確保橋抗體的兩個Fab段之一與第一抗體結合、另一個與抗HRP抗體結合，橋抗體需用高濃度。另外，在非標記抗體酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA)代替橋抗體，進行ICC染色。SPA不受種屬限制，應用范圍廣。

（6)PAP復合物：在PAP法及酶橋法中，特別強調第一抗體和抗HRP抗體必須來自同一種屬，橋抗體才能發(fā)揮橋的作用，將其連結在一起；但一些研究表明：第一抗體和抗HRP抗體來自不同種屬，連結抗體仍可作為橋，將二者連在一起。例如Erlandsen發(fā)現(xiàn)豚鼠IgG作為第一抗體，可用羊抗兔IgG、兔PAP復合物顯示之一。Grzanna（1982)根據這一報告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗體，羊抗兔IgG為橋抗體，12例兔血清制得的PAP復合物中，僅3例染色較佳。這種第一抗體和PAP復合物來自不同種屬獲得的陽性結果主要依賴于種屬間的交叉反應。多數(shù)實驗表明：抗體和種屬交叉反應是有限的，也是不完全的。故利用橋抗體進行ICC染色時，仍以第一抗體和抗酶抗體來自同一種屬為宜。