中國(guó)生物制品規(guī)程:凍干流行性乙型腦炎活疫苗制造及檢定規(guī)程

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本品系將流行性乙型腦炎（下稱乙腦）SA14-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細(xì)胞，經(jīng)培育后收獲病毒液，加保護(hù)劑凍干制成。用于預(yù)防乙腦。1　毒種1.1　毒種來(lái)源乙腦SA14-14-2減毒株病毒。由中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定與分發(fā)。該毒株經(jīng)用乙腦敏感動(dòng)物試驗(yàn)證明其嗜神經(jīng)…

本品系將流行性乙型腦炎（下稱乙腦)SA₁₄-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細(xì)胞，經(jīng)培育后收獲病毒液，加保護(hù)劑凍干制成。用于預(yù)防乙腦。

1　毒種

1.1　毒種來(lái)源

乙腦SA14-14-2減毒株病毒。由中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定與分發(fā)。

該毒株經(jīng)用乙腦敏感動(dòng)物試驗(yàn)證明其嗜神經(jīng)毒力減弱，經(jīng)檢查無(wú)外源因子存在，用乙腦特異性免疫血清做中和試驗(yàn)證實(shí)為乙腦病毒，并經(jīng)免疫力試驗(yàn)證明具有免疫原性，經(jīng)臨床觀察證明安全有效。

1.2　生產(chǎn)毒種批制備

毒種啟封后，在地鼠腎單層細(xì)胞上增殖傳遞，傳遞代數(shù)不得超過(guò)3代。從原始毒種算起，總代數(shù)不是超過(guò)10代。在傳代細(xì)胞病變明顯時(shí)收獲病毒液，經(jīng)檢定合格后為生產(chǎn)毒種批。

1.3　毒種檢定

1.3.bhskgw.cn/yaoshi/1　無(wú)菌試驗(yàn)

按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

1.3.2　支原體檢查

按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

1.3.3　病毒滴定

抽樣品做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細(xì)胞，用蝕斑法進(jìn)行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。凍干毒種批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。做病毒滴定同時(shí)應(yīng)用參考苗進(jìn)行滴定，以判斷試驗(yàn)結(jié)果是否成立。

1.3.4　純毒試驗(yàn)

生產(chǎn)毒種批與非同源性乙腦高價(jià)免疫血清混合，置37℃90分鐘，接種地鼠腎單層細(xì)胞或BHK21細(xì)胞進(jìn)行中和試驗(yàn)，觀察5～7天判定結(jié)果。乙腦病毒完全被中和（無(wú)細(xì)胞病變或蝕斑出現(xiàn))為合格，如仍有病變或蝕斑出現(xiàn)，應(yīng)按上述方法再行中和。

1.3.5　腦內(nèi)致病力試驗(yàn)

生產(chǎn)毒種批原液接種體重12～14g小白鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，接種后3天內(nèi)死亡者不計(jì)，觀察14天應(yīng)活存。3天后如有小白鼠發(fā)病，應(yīng)殺死取腦測(cè)定致病力，對(duì)小白鼠的腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過(guò)3.0LogLD50/0.03ml，同時(shí)小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠腦懸液進(jìn)行皮下致病力試驗(yàn)，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.6　皮下感染人腦試驗(yàn)

生產(chǎn)毒種批原液接種體重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同時(shí)右側(cè)腦內(nèi)空刺，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.7　乳鼠傳代返祖試驗(yàn)

生產(chǎn)毒種批原液接種3～5日齡乳鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.02ml。將發(fā)病的乳鼠殺死3只，解剖取腦測(cè)其致病力，用體重12～14g小白鼠測(cè)定，腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過(guò)3.0LogLD₅₀/0.03ml，同時(shí)皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠腦懸液，觀察14天，應(yīng)健存。

1.3.8　外源因子檢查

生產(chǎn)毒種批經(jīng)非同源性乙腦高價(jià)免疫血清中和后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。樣品分別接種人二倍體細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、原代地鼠腎細(xì)胞，于33～35℃進(jìn)行培育，同時(shí)做對(duì)照培育。培育7、14天細(xì)胞應(yīng)無(wú)病變，分別進(jìn)行次代培育和血吸附試驗(yàn)；次代培育7、14天時(shí)亦分別觀察細(xì)胞病變和進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。結(jié)果均無(wú)細(xì)胞病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。

血吸附試驗(yàn)方法：觀察到期的細(xì)胞，用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細(xì)胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次進(jìn)行血吸附檢查。所用紅細(xì)胞于2～8℃保存應(yīng)不超過(guò)7天。

1.3.9　細(xì)胞基質(zhì)外源因子檢查

制備生產(chǎn)用種子批的細(xì)胞留取5%～10%不種毒，更換相應(yīng)的維持液，置33～35℃培育。在培育7、14天時(shí)，鏡下觀察無(wú)細(xì)胞病變后分別做血吸附試驗(yàn)（方法同1.3.8項(xiàng))。細(xì)胞無(wú)病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。

1.4　生產(chǎn)毒種批保存

液體生產(chǎn)毒種批于-60℃保存不超過(guò)6個(gè)月可用于生產(chǎn)；凍干生產(chǎn)毒種批于-20℃以下保存2年內(nèi)可用于生產(chǎn)。

2　疫苗制造

2.1　細(xì)胞制備

2.1.1　地鼠

選用10～14日齡健康地鼠，解剖取腎。如發(fā)現(xiàn)腎臟異常或有乳糜狀腹水，應(yīng)廢棄。

2.1.2　疫苗生產(chǎn)過(guò)程中不得使用青毒素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。

2.1.3　細(xì)胞消化及培養(yǎng)

解剖取出腎臟后剪成碎塊，用適量的胰蛋白酶液消化，將分散后的細(xì)胞懸液種入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入生長(zhǎng)液，置36～37℃培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層即可接種病毒。

2.1.4　外源因子檢查

每批細(xì)胞留取5%～10%不接種病毒，加入與生產(chǎn)相同維持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天時(shí)分別做血吸附試驗(yàn)（方法同1.3.8項(xiàng))。在觀察期內(nèi)細(xì)胞無(wú)病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。如細(xì)胞出現(xiàn)病變或血吸附試驗(yàn)陽(yáng)性，由該批細(xì)胞制備的病毒原液應(yīng)廢棄。

2.2　病毒接種和培育

挑選長(zhǎng)成致密單層的細(xì)胞，用洗液充分洗滌后加適量維持液，病毒接種量為2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。

2.3　原液

2.3.1　收獲病毒液

種毒后培育72小時(shí)以上，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)收獲病毒液，澄清過(guò)濾后為原液。

2.3.2　原液檢定

2.3.2.1　無(wú)菌試驗(yàn)

每瓶原液分別取樣做無(wú)菌試驗(yàn)，樣品種入硫乙醇酸鹽、乙良馬丁和肝斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)8天判定結(jié)果。

2.3.2.2　支原體檢查

按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程bhskgw.cn/wszg/》進(jìn)行。

2.3.2.3　純毒試驗(yàn)

每一消化批應(yīng)抽樣進(jìn)行純毒試驗(yàn)。方法同1.3.4項(xiàng)。