中國幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌及其感染

1 概述

胃細菌學的研究，長期來是一個被忽視的領(lǐng)域。1983年Marshall和Warren從慢性活動性胃炎患者胃粘膜活檢標本中分離到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp)是對這一領(lǐng)域重要的突破。此后不久即在國際消化病學界引起了巨大轟動，它的發(fā)現(xiàn)對消化病學、特別是胃十二指腸病學的發(fā)展起了極大的推動作用�，F(xiàn)在已經(jīng)清楚它是許多慢性胃�。�慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等)發(fā)生發(fā)展中一個重要致病因子。

1.1 Hp的歷史、發(fā)現(xiàn)和命名

1.1.1 歷史背景

Marshall在分離到Hp后又回過來探索了歷史上的文獻，發(fā)現(xiàn)這一類細菌實際上早就已經(jīng)被人注意過。1893年在狗中，1896年在大鼠和貓中已有人報告在其胃中偶然見到螺形菌。本世紀初在潰瘍性胃癌病人胃內(nèi)容物中曾找到同樣的細菌。其他報告也證實了這一些發(fā)現(xiàn)。也注意到健康人中未發(fā)現(xiàn)這些細菌。經(jīng)過30年的努力，在散載的報告中，良性消化性潰瘍病人胃中發(fā)現(xiàn)了這些細菌。1938年Doenges在一份綜合性尸解研究報告中提出胃中螺形菌的流行率達43％，但是并未檢查出這一細菌與不同的胃部疾病之間的關(guān)系。

關(guān)于這些細菌在人胃疾病中可能的作用一直存在著爭論。有些研究者提出人們在活檢標本中所見到的這種細菌是經(jīng)口吞服的污染物。這一假說1959年由于當時的一位有影響的學者palmer發(fā)表了1000例胃活檢標本大量組織學研究的報告而占了優(yōu)勢。在此以后對胃的細菌學的興趣被潑了一盆冷水。

1975年Steer和Colin-Jones報告了胃潰瘍病人中胃粘液層下的胃粘膜上發(fā)現(xiàn)了細菌，重新引起了人們對胃細菌在消化性潰瘍致病機制中作用的興趣，這提示細菌可能降低胃粘膜的抵抗力，因此易感于潰瘍。Steer等企圖分離這一細菌。結(jié)果生長的是綠膿桿菌。后來仔細審閱文章中的圖片提示在粘膜中所見的是一種與綠膿桿菌無關(guān)的螺形菌�，F(xiàn)在看來這些作者分離到的綠膿性桿菌可能是來自內(nèi)窺鏡的污染菌，而圖片中所見的才是我們現(xiàn)在大家感興趣的Hp。

現(xiàn)在已知Hp能產(chǎn)生大量尿素酶，在發(fā)現(xiàn)Hp之前許多學者曾證明在許多種動物胃中有內(nèi)源性尿素酶活性的存在。1924年Luck和Seth最早描述了這一活性。1955年Kornber和Devies在一篇綜述中下結(jié)論認為胃尿素酶主要存在于胃體部，且來源于細菌。后來在人糞中的研究還證實了這些酶與潰瘍病之間的關(guān)系，甚至有人用尿素治療某些病人取得了療效。

隨著Hp的發(fā)現(xiàn)，人們現(xiàn)在可以把這些研究放在一起得到一個清晰的認識，把胃中的Hp與尿素酶聯(lián)系起來了。在這整個過程中從胃粘膜活檢標本中分離Hp是一個關(guān)鍵因素。沒有這一發(fā)現(xiàn)，人們對胃病的認識仍將受到限制。

1.1.2 發(fā)現(xiàn)和命名

在上述歷史背景以及胃鏡檢查已大大普及、分離培養(yǎng)空腸彎曲菌的微需O2方法已經(jīng)成熟的條件下，Marshall等敏感地意識到胃中所見的螺形菌，形態(tài)上與糞便中分離到的空腸彎曲菌相似。既然用常規(guī)的需O2和厭O2方法都不能把它分離出來，何不用分離培養(yǎng)空腸彎曲菌的方法試一試呢？結(jié)果因此使他們獲得了成功。國內(nèi)是在1985年取得成功的。最初信憑它形態(tài)上與彎曲菌屬細菌相似，分離培養(yǎng)方法也相似，只是從胃標本中分離到的，因此稱作胃彎曲菌樣細菌（gastric campylobacter like organism,GCLO)。不久，由于此菌在胃竇部多見，又改稱作幽門彎曲菌(campylobacter pyloridis,CP)，后來又因為這一名稱不符合細菌統(tǒng)一的拉丁文命名原則，又改為cacpylobater pylori，簡寫與中文譯名未變。隨著對這一細菌的生物學性狀研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)這一細菌雖在形態(tài)和培養(yǎng)特性上與彎曲菌屬細菌有相似之處，但也有許多特性與彎曲菌屬細菌明顯不同。曾有人根據(jù)Hp的16SrRNA的核苷酸序列與彎曲菌屬細菌不同，而與wolinella succinogenes相近，提出應(yīng)歸入wolinella屬。1989年Goodwin等把CP與彎曲菌屬與wolinella屬的代表菌種從超微結(jié)構(gòu)、脂肪酸組成、呼吸醌、生長特點、酶的活性等五種表現(xiàn)型特征上作了系統(tǒng)的比較。他們認為CP既不應(yīng)屬于彎曲菌屬，亦不歸Wollinella屬，應(yīng)另立一個新屬，稱作螺桿菌屬（helicobacter,H)。因之，CP應(yīng)相應(yīng)改稱為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)。而當時已從雪貂胃中分離到的類似Hp的一種campylobacter mustelae相應(yīng)改為雪貂螺桿菌（helicobactermustelae,Hm)。自從新立螺桿菌屬以來，國際上已先后有人從多種動物胃腸道分離到新的菌種認為是屬于螺桿菌屬的，亦有人從過去已歸屬于彎曲菌等屬的細菌中拉出某些細菌來認為應(yīng)歸于螺桿菌。從現(xiàn)有報道看，螺桿菌屬的細菌已不下10余種。其中，除了Hp和Hm以外，還有一種貓螺桿菌（helicobacter felis,Hf)亦已得到較多人的認同以外，其他的尚均還在被認同之中。

1.2 Hp感染與上消化道疾病的關(guān)系

Hp感染與上消化道疾病之間的高度相關(guān)性已有大量報道，且已取得了基本一致的認識如下。

1.2.1 Hp感染與慢性胃炎

Hp與慢性淺表性胃炎之間的病因關(guān)系已充分確立。其證據(jù)如下：①事實上所有Hp陽性者都證實有胃竇炎。②若Hp感染經(jīng)抗菌治療，Hp根除后，胃炎可消退。③在一些動物模型中，接種由患者胃中分離而得到的Hp后，可復制出慢性淺表性胃炎的病損。④Marshall和Morris，分別用患者的Hp對自己作了自身感染，亦取得了同樣結(jié)果。

1.2.2 Hp感染與消化性潰瘍

從現(xiàn)有資料要確立Hp與消化性潰瘍（peptic ulcer diseases,PUD)，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍之間的病因關(guān)系尚有困難。部分原因是缺乏合適的動物模型，而且在Hp感染者中僅有少數(shù)人發(fā)生潰瘍。然而幾乎所有PUD患者都有Hp感染性胃炎。因此，在沒有其他促發(fā)因素，如服用甾體類抗炎藥（NSAID)或有Zollinger-Ellison綜合征存在時，Hp感染與胃潰瘍之間的相關(guān)性稍弱，不是NSAID誘發(fā)的胃潰瘍患者中，80％有Hp感染。然而重要的是要注意到Hp感染者中的大多數(shù)人并不發(fā)生十二指腸或胃潰瘍。這些事實意味著宿主的遺傳性特征，菌株的變異性或其他因子在其中起著作用。Hp感染根除后，潰瘍病復發(fā)率顯著降低，這是Hp在PUD中起病因作用的最有力的證據(jù)。Hp根除后可預防潰瘍病復發(fā)，這在胃潰瘍中證據(jù)不如十二指腸潰瘍那樣充分。在十二指腸潰瘍病例中，奇怪的是有些研究中，Hp在胃竇部部位比發(fā)生潰瘍的十二指腸部位更為常見。胃竇部位的Hp為什么會引起十二指腸病變？已經(jīng)提出的機理包括：Hp在十二指腸胃化的細胞上定居，胃酸或十二指腸碳酸氫鹽的繼發(fā)性改變，或感染菌的產(chǎn)物和／或宿主炎癥應(yīng)答反應(yīng)引起的病變。

1.2.3 Hp感染與非潰瘍性消化不良

Hp感染與非潰瘍性消化不良(NonulcerDyspepsia，NUD)的相關(guān)性尚缺乏令人信服的證據(jù)。因此尚存在著爭論。NUD患者中Hp的感染率并不高于一般人群。

1.2.4 Hp感染與胃部惡性腫瘤

Hp感染與胃腺癌：胃腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。在我國發(fā)病率僅次于肺癌。有證據(jù)顯示Hp感染與胃體和胃竇腺癌相關(guān)聯(lián)。然而，胃癌亦發(fā)生于一些無Hp感染證據(jù)的人。Hp感染的預防和治療對胃癌發(fā)生的危險性的影響，證據(jù)尚不夠充分。流行病學資料表明：胃癌發(fā)生率在一些Hp感染率高的人群中較高。Hp感染率和胃癌發(fā)生率都與社會經(jīng)濟狀態(tài)呈負相關(guān)，都隨著年齡增加而升高。在發(fā)達國家的連續(xù)出生列隊研究中已見下降。在美國，非洲裔美國人和拉丁美洲人的發(fā)生率高于白種人。已發(fā)現(xiàn)，Hp感染率與胃癌死亡率之間存在著地區(qū)分布性的相關(guān)。然而，這兩種病在流行病學上存在一些明顯不一致的情況。例如，胃癌男人比女人高發(fā)，而Hp感染率兩性間并無差別。據(jù)報道，某些人群Hp感染率高，但胃癌發(fā)生率低。這些不一致表明：除Hp感染率外其他因素在胃癌危險因素中亦很重要。在有一些但不是全部回顧性血清學研究中表明，胃癌患者的Hp感染率比對照組高。

感染與胃癌有關(guān)的最有力的證據(jù)來自三個前瞻性列隊血清學研究。這些研究表明Hp感染者的胃癌發(fā)生率顯著增加。在這些研究中，均未見Hp感染與賁門癌和胃食管聯(lián)結(jié)處癌有關(guān)聯(lián)。

Hp感染與淋巴瘤：胃的非何杰金淋巴瘤是一種罕見的病，占胃惡性腫瘤的3％。粘膜相關(guān)淋巴組織性淋巴瘤（MAbhskgw.cn/jianyan/LT)低度克隆的新生物，被認為起源于固有膜中的淋巴樣聚合（Lymphoid aggregate)。初步的流行病學資料顯示，Hp感染與胃非何杰金淋巴瘤和MALT淋巴瘤都相關(guān)。

如果Hp感染與胃癌之間有任何病因關(guān)系，那么顯然別的因素在胃癌的發(fā)生率中亦有重要作用。因此，目前尚不提倡出于預防胃癌的目的而作根除Hp的治療。

2 Hp的生物學性狀

2.1 Hp的形態(tài)學特征

Hp的形態(tài)學已有了充分的描述。總之，它是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌。（圖1)長2.5～4.0μm，寬0.5～1.0μm。革蘭染色陰性。有動力。在胃粘膜上皮細胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形。（圖2)在固體培養(yǎng)基上生長時，除典型的形態(tài)外，有時可出現(xiàn)桿狀或圓球狀。

圖1 Hp的懸滴負染標本透射電鏡（×48000)

圖2 Hp藉鞭毛與部分菌體外膜粘附于胃粘膜上皮細胞表面掃描電鏡（×16000)

電鏡下，菌體的一端可伸出2～6條帶鞘的鞭毛。在分裂時，兩端均可見鞭毛。鞭毛長約為菌體1～1.5倍。粗約為30nm。鞭毛的頂端有時可見一球狀物，實為鞘的延伸物。每一鞭毛根部均可見一個圓球狀根基伸入菌體頂端細胞壁內(nèi)側(cè)。在其內(nèi)側(cè)尚有一電子密度降低區(qū)域。（圖3)。鞭毛在運動中起推進器作用，在定居過程中起拋錨作用（圖3)。

圖3 Hp菌體末端及鞭毛根部的超微結(jié)構(gòu)超薄切片透射電鏡（×5000)

Hp經(jīng)鞣酸處理，發(fā)現(xiàn)其外表面被厚達40mm的糖萼（glycoculyx)所包裹。電鏡下，由于其呈細絲網(wǎng)狀，與胃上皮細胞表面連接，因此亦有人稱之為纖毛或擬菌毛。它成為Hp粘附于胃上皮細胞表面的主要物質(zhì)基礎(chǔ)（圖4)。Hp定居于胃上皮細胞表面，除了鞭毛和糖萼的作用以外，在電鏡下，尚可見到菌體細胞壁與胃上皮細胞細胞膜表面直接相貼的現(xiàn)象（圖5)。這種現(xiàn)象的機理可能與藉糖萼粘連的機理不一樣。其本質(zhì)及其有何特殊意義有待研究。

圖4 Hp藉擬菌毛粘附定居于胃上皮細胞表面超薄切片透射電鏡（×70000)

Hp:幽門螺桿菌

Ep:胃上皮細胞

圖5 Hp部分細胞壁與胃上皮細胞部分細胞膜直接相貼超薄切片透射電鏡（×60000)

Hp：幽門螺桿菌

Ep：胃上皮細胞

培養(yǎng)物中的Hp，用懸滴法作電鏡觀察時，常見菌體外圍有“炸面圈樣”或“指突狀”結(jié)構(gòu)包裹。這些結(jié)構(gòu)有何含義亦不清楚。

延長培養(yǎng)時間，典型的細菌會發(fā)生圓球樣形態(tài)的變化。這可能就屬于Hp的L型。它亦可在暴露于大氣（含O2量較高)時發(fā)生。這種圓球體（圖6)有兩種類型。一種較大，電鏡下可見稀疏的細胞質(zhì)，細胞體積膨大。這種類型可能是一種退化型，在傳代中不能再生長。另一種小圓球體，電鏡下可見電子密度較高的細胞質(zhì)，且有完整的細胞膜。這種類型可能比前者有較高含量的KDO和蛋白質(zhì)。它已經(jīng)被證明至少在30d內(nèi)對物理和化學因素有一定的耐受性。且在4周～6周內(nèi)在合適的培養(yǎng)條件下能重新生長成繁殖體�？墒瞧�今尚未能證實這種圓球體在自然環(huán)境中的持續(xù)存在。或許這是弄清Hp感染的流行病學和某些治療中失敗的原因的關(guān)鍵因素。

2.2 Hp的生理學特征

2.2.1 Hp的生長和生存條件

Hp是一種專性微需O2菌。它的穩(wěn)定生長需要依靠在生長的微環(huán)境中含2％～8％O2。因此，它在大氣中和絕對厭O2條件下均不能生長。從臨床標本中分離野生株都必需補充適量的CO2。早期認為Hp并不在代謝中利用碳水化合物獲得能量，而是利用有機酸和氨基酸。但是不久前Reymolds等研制了一種合成培養(yǎng)基證明精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸是Hp的必需氨本酸。有一些株尚需要丙氨酸或絲氨酸。但沒有葡萄糖時，Hp仍不能生長。有適量葡萄糖和丙氨酸時能大大促進其生長。這說明葡萄糖可能仍然是Hp能量和碳源的重要來源之一。Hp只含有MK－6呼吸醌，不含有所有彎曲菌屬中普遍存在的甲基化MK－6呼吸醌。

許多固體培養(yǎng)基能用作分離培養(yǎng)Hp的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。例如：心腦浸液瓊脂、哥倫比亞瓊脂、布氏瓊脂和M－H瓊脂等。但必需加入適量的全血（馬、羊或人)或胎牛血清作為補充物。加入適量的活性炭（0.2%)或淀粉（1％)亦有利于吸收培養(yǎng)基中衍化產(chǎn)生的毒性氧離子。Hp生長緩慢，通常需要3d～5d，甚至更長時間，才能形成針尖狀小菌落,為了避免快速生長的兼性厭O2菌和霉菌等和過度生長，常需加入由萬古霉素、TMP、兩性霉素、多粘菌素等組合的抑菌劑。Hp在液體培養(yǎng)基中生長更加困難。這可能與在液體里面更難保證菌體周圍穩(wěn)定的微含O2量環(huán)境有關(guān)。

有人報告Hp能在33°C～40.5°C和pH6.6～8.4條件下生長。但實際應(yīng)用中仍以37°C和pH7.0～7.2為最適條件。Hp對低ph 比一般細菌有較強耐受力。電鏡下，甚至偶然可見Hp鉆入壁細胞的分泌小管中（圖7)。Clyne等認為酸對pH既有殺傷作用的一面，亦有保護作用的一面。他們把尿素酶陽性的野生株N6和尿素酶陰性的突變株分別接種在含有或沒有10mmol尿素的兩個pH范圍從2.2到7.2的37°CPBS中,30min，然后測量CFU／ml、上清液的pH和溶液中的氨量。結(jié)果N6株在沒有尿素的pH4.5～7.0的PBS中生存良好，甚至在有尿素的超始pH為3.5的溶液中亦能生存。然而野生株和突變株均不能在堿性環(huán)境中生長繁殖。存在野生株和尿素的酸性溶液的pH迅速從3.5升至8.45。尿素酶突變株在pH4.5～7.2的溶液中存活，不對尿素起反應(yīng)。野生株N6暴露于氨的濃度高達80mmol仍能存活。胃的酸性環(huán)境可能對存活于尿素中的Hp有殺傷作用。但是Hp決不能存活于含有尿素的正常環(huán)境中，因為隨后升高的pH的危害性遠超過氨的毒性。

在血瓊脂中，Hp不能在含有5％膽汁的情況下生長。但是暴露于含有5％膽汁的液體培養(yǎng)基中30min，只有25％的Hp被殺死。這說明Hp通過十二指腸時尚有生存的可能性。

在含有0.1 %到1.5%甲基纖維素的1％蛋白胨的粘稠深液中，有周鞭毛的大腸桿菌在20CP（厘泊)，即被制止運動。而Hp在10CP比1CP游動得更快，甚至在200CP的粘稠培養(yǎng)基中仍能游動。這可能與Hp的螺旋形特征及鞭毛的旋轉(zhuǎn)推動作用有關(guān)。由此，使Hp很容易穿透胃粘膜表面的粘液層，達到胃粘膜上皮細胞表面定居。而其他細菌很難達到這一點。

2.2.2 Hp的生化反應(yīng)和酶

Hp對臨床實驗室中常用于鑒定細菌的大多數(shù)經(jīng)典試驗不起反應(yīng)。但是有幾種酶的反應(yīng)是有特點的，特別是尿素酶，常用作Hp的生化鑒定。

尿素酶 尿素酶是Hp的一個非常重要的酶。它能使尿素分解成二氧化碳與氨。用柱層析方法測得其分子量約為625±kD，與底物有高度親和性。它與變形桿菌屬、摩根菌屬、普羅威登斯菌屬等許多微生物產(chǎn)生的尿素酶相比，在分子量大小、電泳活性、等電點和對尿素酶抑制劑的敏感性等方面都有它的獨特性。Hp在固體培養(yǎng)基上和胃粘膜上能產(chǎn)生大量尿素酶，而且其酶的活性比其他微生物產(chǎn)生的尿素酶活性高幾倍到幾十倍，甚至更大。尿素酶不僅是Hp得以在胃粘膜表面定居的必要條件，可能也是Hp在胃部致病的重要因素之一。傳統(tǒng)的測定尿素酶的方法，如Christensen尿素培養(yǎng)基等，均可用于測定Hp的尿素酶。由于Hp的發(fā)現(xiàn)和臨床上對快速診斷Hp感染的需要，已由此發(fā)展出了許多種更加簡便有效的或者能作非侵襲性體內(nèi)診斷用的試驗。

其他可用于Hp常規(guī)鑒定用的酶試驗Hp的分離培養(yǎng)物的生化特性往往非常穩(wěn)定。它們都能產(chǎn)生氧化酶、觸酶、尿素酶、堿性磷酸酶、α－谷氨酰胺肽酶、亮氨酸胺肽酶和DNA酶。不產(chǎn)生其他44種酶（包括許多種氨肽酶、酯酶、糖甙酶等)。常規(guī)鑒定可參見表1。

表1Hp與相關(guān)細菌的生化特征比較

aHp=Helicobacter pylori Ws:Wollinellasuccinegenes Hf=Helicobacter Cj:Campylobacter jejuni Hm=HelicobactermustelaeNDb：未確定

2.2.3 對抗菌藥物的敏感性

在體外，Hp對大多數(shù)抗菌制劑敏感。但對萬古霉素和TMP高度耐藥�；沁疗S頭孢霉素（Cefsulodin)，多粘菌素B及萘啶酸對少數(shù)菌株以外也都不起作用。這些抗菌藥物可用于制備Hp的選擇性培養(yǎng)基。許多抗菌藥物在體外對Hp的高敏感性和在體內(nèi)的低效或無效之間的矛盾，可能涉及許多因素。除了Hp自身發(fā)生的耐藥性突變外，恐怕還受到藥物在胃腔內(nèi)對Hp作用的條件（胃酸作用的強度、不溶性粘液層的阻隔、不斷的排空運動等)影響。Hp對常用抗菌藥物的敏感性見表2。近年來由于臨床上廣泛應(yīng)用滅滴靈、克拉霉素（Clarithromycin)等抗菌藥物治療慢性胃炎及消化性潰瘍。因此，臨床上對這些藥物的耐藥菌株已越來越多見。

表2 Hp對常用27種抗菌制劑的敏感性

aMIC:Minimal inhibitory concentration

2.2.4 粘附性

自然條件下，大量Hp僅出現(xiàn)在胃上皮細胞表面，細胞間隙及胃小凹中，而不出現(xiàn)在其他組織細胞表面（圖8)，說明Hp對胃上皮細胞有特殊的親和性。后來人們也發(fā)現(xiàn)Hp對某些動物和人的RBC會發(fā)生聚集反應(yīng)。作者還在Hp與“O”型血的血凝塊的超薄切片中發(fā)現(xiàn)，Hp與“O”型RBC（后來證實按Lewis分型屬Leb型”，及Hp與胃粘膜上皮細胞之間的關(guān)系，在高倍電鏡下所見非常相似（圖9)。這些特異的親和現(xiàn)象很可能暗示著類似的粘附機制。1993年有人發(fā)現(xiàn)Hp特異地粘附于人胃粘膜上皮細胞受到人類初乳中SCIgA（一種攜帶高度多變的N－和O－連接的單糖鏈的糖蛋白)的抑制。當這種SC-IgA被墨角藻糖酶（α－L－fuco-sidase)降解后，抑制作用即降低，若用唾液酸（sialic acid)處理（曾有人報道Hp表達唾液酸特異的凝集素)，并不降低其結(jié)合力。這一結(jié)果證明Hp在胃粘膜上皮細胞上的受體含有墨角藻糖(fucose)。而墨角藻糖結(jié)合的血型抗原，典型地在RBC上發(fā)現(xiàn)，也在人上皮細胞表面表達。Boren等為了弄清墨角藻糖酶敏感的Hp受體結(jié)構(gòu)，他們比較了sc-IgA與S-IgA分子含有的不同墨角藻糖碳水化合物鏈的棋盤分析（Panel analysis)。最后他們證實了在人胃粘膜表面的Hp受體含有RBc Lewis分型的Leb抗原。他們還證實了Leb抗原是分泌型體質(zhì)個體胃上皮細胞表面表達的最顯著的血型相關(guān)抗原，而Lea 抗原是非分泌型體質(zhì)個體中占相當優(yōu)勢的血型抗原。因此，陽性分泌型體質(zhì)個體可能對Hp比較易感。胃潰瘍個體的流行病學調(diào)查中也證明了Hp感染在Leb陽性的個體中較高發(fā)。

2.2.5 菌種保存

傳統(tǒng)的凍干方法并不適宜于Hp的保存。有人曾用棉簽沾取Hp的液態(tài)培養(yǎng)物凍干取得成功。但是目前置－70°C或置液氮中冷凍是常用保存方法。

2.3 Hp的分子生物學特征及菌株標識

2.3.1 分子生物特征

脂肪酸組成，一種細菌獨特的脂肪酸組成常常與該菌的分類命名、細胞膜的生理化學特性和該菌的生物學性狀有關(guān)。在早先許多學者都對Hp的脂肪酸組成作了測定。盡管測得的數(shù)值略有出入，但多數(shù)學者認為Hp經(jīng)甲基化處理由氣相色譜儀測得的數(shù)值表明：Hp的主要脂肪酸有十四烷酸（C14:0)、十六烷酸（C16:0)、十六碳稀酸（C16:1)、十八烷酸（C18:1)、順式9、10亞甲基十八烷酸（C19:0cyc),但是缺少了一羥基十四烷酸（3－OH－C14:0)。

Inamoto等深入地研究了Hp的脂質(zhì)和脂肪酸。他們發(fā)現(xiàn)Hp的脂肪主要由膽固醇酯、三油酸甘油酯、游離脂肪酸、膽固酸、二�；�甘油和一�；�甘油等簡單脂質(zhì)組成。且在這些脂質(zhì)中均含有11－甲氧基十七烷酸（11－OMeC17:0)和11－甲氧基十九烷酸（11－OMe C19:0)兩種獨特脂肪酸。與BCG的耐酸性相比，兩者均有耐酸性，雖程度有所不同。他們認為Hp脂質(zhì)與脂肪酸的特征可能是構(gòu)成Hp亦具有耐酸性和與BCG耐酸強度不同的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)組成Hp的菌體蛋白質(zhì)含量通常用SDS－PAGE方法測定。用這一技術(shù)測得的結(jié)果，不同分子量的蛋白質(zhì)條帶很多，不同菌株看上去似乎很一致。但是用激光光密度計掃描，并用電腦分析比較，顯示它們之間是存在差別的。所有的株的蛋白質(zhì)條帶80％是相似的，若以91％相似為閾值，可把Hp分成不同的電泳型。Hp的SDS－PAGE電泳譜中部分條帶含有Hp的特異性抗原，也有一些條帶含有與彎曲菌屬細菌的共同抗原。由于技術(shù)條件未統(tǒng)一，各家報道的結(jié)果均略有上下。1990年Cover等從消化性潰瘍患者活檢標本中分離到的Hp，在肉湯培養(yǎng)物中用SDS－PAGE測到一種82kD大分子量的蛋白質(zhì)。它只能在使細胞產(chǎn)生空斑作用的上清液中出現(xiàn)。另外用免疫印跡法以人血清能在產(chǎn)生空斑作用的上清液中識別出128kD的蛋白質(zhì)條帶。兩者在產(chǎn)生空斑作用的上清液中出現(xiàn)的頻率之間沒有顯著性差異。但是由于82kD蛋白質(zhì)不易被人的血清識別。而對128kD蛋白質(zhì)起血清學反應(yīng)的抗體在消化性潰瘍病人中比無消化性潰瘍病的Hp感染者中更為常見。這意味著這兩種大分子量蛋白質(zhì)可能與Hp的致病性有關(guān)。后來人們把前者82kD蛋白質(zhì)稱作空泡毒素CacA，把后者128kD蛋白質(zhì)稱作細胞毒素相關(guān)蛋白CagA。而且經(jīng)其他學者的工作發(fā)現(xiàn)，CagA蛋白質(zhì)的分子量飄移在128－140kD之間。項兆英等人對43株Hp CagA和VacA毒力因子表達的分析揭示，能把臨床分離株分成兩種主要類型。Ⅰ型細菌含有CagA和VacA基因，表達CagA和VacA蛋白；Ⅱ型細菌不含CagA基因；不表達CagA和VacA蛋白。Ⅰ型和Ⅱ型細菌分別占56％和16%，而其余的為中間表型，即僅表達其中一種毒力因子。這一發(fā)現(xiàn)證明盡管許多細胞毒性Hp株含有CagA，但是VacA的表達可以不需要CagA的存在。

Hg的鞭毛可將其液體培養(yǎng)物藉著震蕩脫落下來，然后再經(jīng)過梯度離心等方法使其純化。現(xiàn)知鞭毛蛋白中含有57kD與56kD兩種鞭毛素亞單位，它們與彎曲菌屬的細菌的鞭毛素具有共同的抗原決定簇。但是56kD的鞭毛素尚具有對Hp特異的氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

核酸 早期人們企圖判斷Hp是否與彎曲菌屬同屬，測試了它的DNAG＋Cmol%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其數(shù)值與彎曲菌屬的數(shù)值范圍（30mol～38mol%)完全重疊。因此這一方法在鑒別Hp與彎曲菌上毫無意義。后來人們根據(jù)Hp的16SrRNA才發(fā)現(xiàn)與彎曲菌屬細菌不同。隨著分子生物學的發(fā)展，人們迅速地投入了對Hp各種特殊的基因的研究。最早克隆成功的是尿素酶基因。到1995年7月EHpSG(EuropeanHelicobacter pylori Study Group)在愛爾蘭召開的第八屆胃十二指腸病理學與幽門螺桿菌國際會議上已介紹了不下十余種Hp不同的基因組或基因的研究工作�；�中包括：趨化因子cheA和cheY、鞭毛素基因flaA和flaB、鞭毛生物合成調(diào)節(jié)基因flbA、鞭毛外鞘蛋白基因、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因nixA、熱休克蛋白質(zhì)基因hspA、尿素酶基因ureA、ureB、ureC、修復基因racA、空泡毒素基因VacA、細胞毒素相關(guān)基因CagA、CagC，細胞毒素第二相關(guān)基因CagII堿性磷酸酶基因組等。由此可見，對一種病原性細菌來講，Hp基因研究所涉及領(lǐng)域之寬，進展速度之快是前所未有的。為了避免在這一研究領(lǐng)域發(fā)生混亂，大會上有一些學者呼吁為Hp的基因和基因組的統(tǒng)一命名制訂規(guī)則。他們建議：①Hp基因同源于其他細菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因，給于同樣名稱。例如ureA、ureB、flaA等。②完全新發(fā)現(xiàn)的基因，根據(jù)它們編碼的蛋白質(zhì)的功能或作用命名。例如：VacA。③當同源性不是太明顯，新基因的功能還未完全確立，可以給予一個獨特的臨時性的名稱。例如：CagA、CagII等。下面就研究得較多和較重要的兩類基因作一介紹。

①尿素酶基因：1988年Labigne用穿梭載體（shurttle vecter)Pill500把Hp對應(yīng)于尿素酶基因的DNA片段克隆出來，在大腸桿菌和空腸彎曲菌之間復制和轉(zhuǎn)移獲得了成功。但是它并不能在大腸桿菌中表達尿素酶活性，只有在接合于空腸彎曲菌時才能暫時地生物合成尿素酶。重組的粘尾質(zhì)粒（recombinant cosmid)piLL585，具有33.2kb。它經(jīng)過再克隆成8.1kb片段piLL590后才能把尿素酶的表型特征轉(zhuǎn)輸給空腸彎曲菌的受體株。此后，經(jīng)過反復不斷再克隆刪除了不必要的部分后，尿素酶的基因最后定位在DNA的4.2kb區(qū)段內(nèi)。用雙脫氧法（dideoxy)測序，發(fā)現(xiàn)有四個開放讀框(open reading frame)，分別編碼四個預知分子量的多肽。它們分別是26000(ureA)、61600（ureB)、49200（ureC)和15000（ureD)。ureA和ureB編碼的多肽與尿素酶結(jié)構(gòu)的兩個亞單位是相當?shù)�。它們與奇異變形桿菌尿素酶二個亞單位和刀豆尿素酶獨一無二的亞單位高度同源。符合率分別是56％和55.5％。雖然ureD編碼的多肽，與膜穿透蛋白質(zhì)功能有關(guān)。但是對這一多肽與ureC編碼的多肽均未明確其作用。從DNA序列圖譜上看，表明這些多肽對把尿素酶活性轉(zhuǎn)移給空腸彎曲菌受體是必需的。

②細胞毒素相關(guān)基因CagA和空泡毒素VacA：自從發(fā)現(xiàn)Hp高分子量抗原與消化性潰瘍病有關(guān)后，引起了人們對它的基因的興趣。Tumuru等用λZapII構(gòu)建了Hp84－183的隨機染色體片段文庫。在大腸桿菌YLi-Blue的多個文庫中用Hp感染者經(jīng)過吸收的血清篩選。結(jié)果分離純化出一個3.5kb插入片段的克隆。這一插入片段的再克隆能表達出一種Hp的重組蛋白質(zhì)。它的分子量接近96kD，且能被人的血清所識別。得自Hp感染者和能識別天然的120～128kdHp抗原的血清，它們識別重組的96kD PMC3蛋白質(zhì)的能力明顯地大于不能識別天然的Hp抗原的血清。所有19株Hp產(chǎn)生的120kD～128kD抗原均能與PMC3產(chǎn)生斑點雜交。沒有一個不產(chǎn)生同一抗原的得到同一結(jié)果。（P＜0.001)。因為15個產(chǎn)生空泡毒素的Hp臨床分離株均與PMC3產(chǎn)生雜交。Tumuru等稱這一基因為細胞毒素相關(guān)基因（cytotoxin-associated gene,CagA)。PMC3的序列分析證實有一個含859個氨基酸的開放讀框，沒有終端子。另外用人血清篩選λgtII文庫還顯示出一個能產(chǎn)生噬菌斑的0.6kb插入片段，其序列與PMC3下游序列吻合。為了克隆出全長度的基因，他們用0.6kb片段為探針從λZapII基因庫中分離出一個含2.7kb插入片段的克隆。這一插入片段pYB2的核苷酸序列顯示為785bp，與pMC3下游區(qū)域的序列恰好重疊。CagA全核苷酸序列的翻譯揭示有一個產(chǎn)生分子量達131.517kD的1181個氨基酸組成的蛋白質(zhì)的開放讀框。這些結(jié)果與先前報道過的蛋白質(zhì)序列沒有明顯的同源性。這些發(fā)現(xiàn)表明Hp高分子量抗原的克隆和特征可能與Hp的毒力和空泡毒素的產(chǎn)生有關(guān)。

至于Hp的空泡毒素，Telford根據(jù)已知Hp空泡毒素23個氨基酸組成，取其分別對應(yīng)于最初和末了6個氨基酸組成的單核苷酸序列作PCR反應(yīng)。并以PCR產(chǎn)物作探針探查Hp全菌DNA用HindIII酶切的文庫，并克隆入其本質(zhì)粒載體（bluescript plasmidvector)，分離到含有～3kb插入片段的克隆。隨后從用EcoRI酶切的文庫分離出的7kb插入片段，也覆蓋HindIII克隆的120bp區(qū)段。這兩個片段均含有完整的基因。此基因含有唯一的較長的開放讀框，能編碼1296個氨基酸，分子量為139.7kD的蛋白質(zhì)。由起動子，核糖體結(jié)合部位，終端子組成。最前面的33個氨基酸似乎是細菌信號肽，提示蛋白質(zhì)是藉分泌決定機制（Sec-dependent mechanism)輸出的。從34～56序位是與純化的NH2－終端編序決定的23個氨基酸是一致的。然后，他們又用基因的不同區(qū)段在大腸桿菌中表達，產(chǎn)生了五種融合蛋白。并用免疫印跡法最后證實94kD的融合蛋白與前述的空泡推測基因相對應(yīng)。

2.3.2 菌株標識

有人曾經(jīng)企圖對Hp進行生物學分型，但是沒有獲得明顯的成功。盡管對蛋白質(zhì)的SDS－PAGE及對全菌DNA的指紋分析會顯示菌株之間的微細差異，但似乎并不實用。因為菌株與菌株之間的差異太微細、太多，難于識別。近年來在PCR反應(yīng)發(fā)展的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了RAPD（Randomamplified polymorphic DNA)和RFLP（Restriction fragment length polymorphism)兩種識別Hp不同種株的技術(shù)，這將為Hp的流行病學調(diào)查提供一些有效的方法。

3 Hp的致病與免疫性

Hp感染幾乎總是與炎癥反應(yīng)同時并存。但是消化性潰瘍與胃癌只在一小部分Hp感染者中發(fā)生。盡管國內(nèi)外對Hp感染的致病機制已從臨床資料及體外試驗中作了大量資料積累。對它的致病機制也有了一些初步解釋。但是仍然很少經(jīng)過合適的動物模型的驗證。因此它的確切致病機制現(xiàn)在仍然知道得不是很多。至于它的免疫性更是如此。

3.1 Hp的致病性

下面就胃十二指腸幾個與Hp感染有關(guān)的主要疾病的發(fā)生學說作一些介紹。

3.1.1 胃炎的發(fā)生學說

正常情況下，胃壁有一系列完善的自我保護機制（胃酸、蛋白酶的分泌功能，不溶性與可溶性粘液層的保護作用，有規(guī)律的運動……等)，能抵御經(jīng)口而入的千百種微生物的侵襲。自從在胃粘膜上皮細胞表面發(fā)現(xiàn)了Hp以后，才認識到Hp幾乎是能夠突破這一天然屏障的唯一元兇。盡管也有報道另一種人胃螺菌（Gastrospirilumhominis,Gh,現(xiàn)又有人稱之為Helicobacter heilmanii)亦能在人胃壁上定居，但其陽性檢出率所占比例平均一般僅及Hp的1%以下。Goodwin 把Hp對胃粘膜屏障在破壞作用比喻作對“屋頂”的破壞給屋內(nèi)造成災(zāi)難那樣的后果，故稱為“屋漏”學說。目前對Hp感染的研究能歸入這一學說的資料最多（見表3)。主要包括①使Hp穿透粘液層在胃上皮細胞表面定居的因素；②對胃上皮細胞等起破壞作用的毒素因子；③各種炎癥細胞及炎癥介質(zhì)；④免疫反應(yīng)物質(zhì)等。這些因素構(gòu)成Hp感染的基本病理變化，即各種類型的急、慢性胃炎。其中近年來得到最重要關(guān)注的是空泡毒素VacA、細胞毒素相關(guān)蛋白質(zhì)CagA，和尿素酶等的作用及其分子生物學研究（見前述)。

表3 Hp可能的致病因子及炎癥反應(yīng)

　　3.1.2 消化性潰瘍的發(fā)生學說

Hp感染明顯地增加了發(fā)生十二指腸和胃潰瘍的危險性。大約1/6Hp感染者可能發(fā)生消化性潰瘍病。治療Hp感染可加速潰瘍的愈合和大大降低潰瘍的復發(fā)率。不用抑酸劑，單用抗Hp藥物治療，表明也能有效地治愈胃和十二指腸潰瘍。Hp感染已經(jīng)與一些引起潰瘍病的原因找到了聯(lián)系。例如：胃酸增加、十二指腸胃化生、粘膜屏障性質(zhì)的改變、胃竇粘膜產(chǎn)生炎癥代謝產(chǎn)物等。這些患者中的發(fā)現(xiàn)已在動物實驗中得到初步證明。實際上消化性潰瘍涉及幾個復雜的相互作用的機制。如細菌的毒力因素（VacA和CagA等)，宿主的反應(yīng)性（例：如易感性的遺傳、十二指腸上皮的胃化生、粘膜屏障和炎癥的相互作用、泌酸反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)作用)和環(huán)境因素（例如飲食、獲得感染的年齡)的綜合作用導致潰瘍的最后結(jié)果。過去臨床上對潰瘍的發(fā)生有一句諺語，叫“no acid,no ulcer”�，F(xiàn)在，從現(xiàn)代理論來看,“no Hp,noulcer”應(yīng)得到更多地強調(diào)。

3.1.3 胃癌的發(fā)生學說

胃癌是世界上腫瘤中僅次于肺癌的死亡原因。美國胃癌于1930年占腫瘤死亡原因首位。到現(xiàn)在已下降到較低水平（1985年為第9-10位)這一發(fā)生率的顯著下降有利于研究這一疾病的致病機制.事實上，作為結(jié)果，胃癌可被認為在人類惡性病變中了解最清楚的。自從發(fā)現(xiàn)了Hp以后，對胃癌的發(fā)生提出了一些新的看法。

從早期描述的流行病學和臨床資料研究的結(jié)合，腸型胃癌的學說早已形成。當時認為環(huán)境因素導致胃刺激，引起淺表性和萎縮性胃炎。低胃酸癥，接著發(fā)生細菌過量生長，使亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成N-硝基胺（N-nitrosamines)，引起組織異化，最后發(fā)生腫瘤。維生素C和β-胡蘿卜素藉著它的抗硝基胺作用和抗氧化物作用會防止疾病的后期發(fā)展。這一得到廣泛支持的學說是很有力的，但不能解釋所有問題。自從清楚Hp感染是慢性胃炎主要原因，且在未治療條件下幾乎可以持續(xù)終生，引起了人們對胃癌形成學說的修正。從近年來對Hp感染的大量研究中提出了許多Hp致胃癌的可能機制：①細菌的代謝產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化粘膜；②類同于病毒的致病機制，Hp DNA的某些片段轉(zhuǎn)移入宿主細胞，引起轉(zhuǎn)化；③Hp引起炎癥反應(yīng)，其本身具有基因毒性作用。在這些機制中，后者似乎與最廣泛的資料是一致的。

體外和體內(nèi)實驗中，均見Hp引起細胞增殖。有人提出這是淋巴因子中的上皮細胞生長因子引起的。另一些人把它與尿素酶產(chǎn)生的氨聯(lián)系起來。炎癥細胞的增加對上皮細胞的增殖會增進危險性。中性粒細胞產(chǎn)生O2、H2O2、HOCL和氯胺等都能引起DNA鍵斷裂，損害堿基對，和姊妹染色單體交換（sister chromatidexchanges)。突變原性的反應(yīng)性O(shè)2產(chǎn)物的過量產(chǎn)生也已被Hp感染人類粘膜組織的化學發(fā)光（chemiluminesence)所證實，由此，Hp感染不僅引起有絲分裂，還提供了內(nèi)源性突變原的來源。

Hp感染引起的細胞增殖，藉著①復制錯誤，②內(nèi)源性炎癥相關(guān)突變原，③飲食中外源性突變原三種機制增加對DNA損壞的危險性。大多數(shù)損壞的DNA能被機體正常的保護機制所修復。但是檢查和修復的能力并不是總是那樣的完美無缺的。上皮細胞中引起的有些DAN損壞可保留很長時間。感染期越長，不適當?shù)男迯涂赡苄栽酱�。最后轉(zhuǎn)化成惡性。人們感染Hp在年青時期，他們產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，會增加腫瘤的危險性。假若這些人包含中會有較高的外源性致癌原和較低的抗氧化劑，它們的危險性會互加起來。雖然有些個體中感染或飲食已能單獨解釋腫瘤的成因，但兩者的互加更能顯示它們之間的協(xié)同作用。

3.2 Hp的免疫性

3.2.1 對Hp的體液免疫反應(yīng)

通常對大多數(shù)Hp感染體液免疫反應(yīng)的研究只是用在診斷上。Doig等用單克隆抗體的方法描述了Hp表面暴露抗原蛋白質(zhì)的性質(zhì)。他們鑒定的暴露表面的抗原包括有分子量分別為80、60、51、50、48、和31kD的各種外膜蛋白質(zhì)。LPS的核心區(qū)域和鞭毛外鞘也被識別為Hp抗原。50、48和31kD的是不同株所共有的，而其余的為株特異性抗原。這些抗原成分和在感染病人血清中相應(yīng)的抗體可能是有用的致病性和診斷的標記。用免疫印跡法，不同感染病人血清中并不能測得同樣的抗原組成。這提示病人對這些抗原的抗體反應(yīng)的個體差異。而且這提出了一個問題：這種抗體反應(yīng)異質(zhì)性的意義是什么？

Krenning等研究了IgG、IgA和Hp定居密度及胃炎嚴重程度的關(guān)系，他們認為IgG反應(yīng)的強度與Hp定居的密度及胃炎的嚴重程度相關(guān)。但是IgA反應(yīng)與胃竇炎強度有關(guān)，而不與胃竇部Hp定居密度和活性程度有關(guān)。IgA水平也與胃體部Hp定居密度和胃炎強度有關(guān)。

3.2.2 對Hp感染的細胞和炎癥局部反應(yīng)

在體外受到Hp抗原刺激后，來自Hp陽性病人外周血或胃粘膜固有層的T淋巴細胞的增殖和α-干擾素的產(chǎn)生比Hp陰性病人均有所下降。在Hp陽性病人胃粘膜固有層中某些淋巴細胞亞群（CD8和CD22)比Hp陰性病人中有所增加。這表明活躍的T淋巴細胞受到Hp抗原抑制，且可以部分解釋免疫反應(yīng)為什么對根除Hp無能。

Takemura等為了確定Hp水浸出液激活的中性粒細胞是否會破壞內(nèi)皮細胞單層，并涉及這一過程的機制。他們把人類中性粒細胞與加入或沒有加入Hp浸出液的人類臍帶靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs)單層一起培養(yǎng)。結(jié)果Hp浸出液激活的人類中性粒細胞使內(nèi)皮細胞從HUVECs單層上脫落下來。其嚴重程度取決于暴露的時間，但是內(nèi)皮細胞的脫落可以藉直接抗中性粒細胞上的CD11/CD18單克隆抗體或抗內(nèi)皮細胞上的細胞粘附因子1單克隆抗體防止。HUVEC單層的互解也可以藉超氧化物歧化酶、觸酶和抗彈性硬蛋白酶（elastase)的單克隆抗體防止。進一步的研究表明Hp的浸出液是能抑制人的中性粒細胞彈性蛋白酶的。抗彈性使蛋白酶的作用不因氧化劑減弱。這些研究表明Hp浸出液激活的人類中性粒細胞能破壞HUVEC單層只有在人中性粒細胞能破壞HUVECs時，由此，對體內(nèi)觀察到的由Hp浸出液引起的中性粒細胞依賴的血管蛋白質(zhì)泄漏提供了一個解釋。Hp釋放的多種抗蛋白質(zhì)酶的可能性，可以部分地解釋為什么這一細菌的毒力是如此的強。

4 Hp感染的診斷、治療和流行病學

4.1 Hp感染的診斷

自1983年通過胃鏡取活檢標本分離培養(yǎng)成功以來，對Hp感染的診斷已發(fā)展出了許多方法，包括有細菌學、病理學、血清學、同位素示蹤、分子生物學等許多方法。但總的講來，從標本采集角度看，可以分為侵襲性和非侵襲性兩大類。

4.1.1 Hp感染的診斷

侵襲性方法主要指必需通過胃鏡取活檢標本檢查的方法。它是目前消化病學科的常規(guī)方法。它包括細菌的分離培養(yǎng)和直接涂片、快速尿素酶試驗，藥敏試驗。病理學的組織切片檢查，電鏡檢查及分子生物學的PCR，RAPD，RFLP等。其中分離培養(yǎng)+直接涂片鏡檢或分離培養(yǎng)+病理切征檢查被國際上分認為判斷其他各種方法準確性可靠性的依據(jù)，即所謂“金標準”�？墒荋p是一種微需O₂菌，分離培養(yǎng)較困難。需要有一定的技術(shù)設(shè)備條件，因此在許多醫(yī)院，甚至在較大的醫(yī)院，亦未能普遍開展此項工作�，F(xiàn)在看來，分離培養(yǎng)條件掌握得好，若能在胃壁不同病灶部位（因Hp感染灶在胃壁上分布不勻)取兩塊活檢標本作分離培養(yǎng)，Hp的陽性檢出率幾乎可以達到90%以上，甚至接近100%。目前臨床普遍采用的還是病理組織切片和快速尿素酶兩種方法。病理切片HE染色特異性較差，Warthin-Starry鍍銀染色法較好�？焖倌蛩孛冈囼炗捎谑袌錾嫌兴幒泄�應(yīng)，有的自己配制，使用很方便。但是由于產(chǎn)品質(zhì)量標準不統(tǒng)一，結(jié)果出入很大，因此在臨床應(yīng)用上造成了一些混亂。

PRC從理論上講，本來是一種很敏感的、特異性亦較好的方法。但是必須具有合適的引物，良好的設(shè)備，嚴格的實驗條件才能成功地進行。因此目前在臨床上僅用于研究，尚未普遍開展。隨機擴增多形性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD)及限制性片段長度多形性（Restriction fragment length polymorphism,RFLP)試驗是PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的兩種方法。它們共同特點是能區(qū)別Hp株的特異性。因此在追蹤Hp的傳染源或判斷潰瘍病的復發(fā)是由于Hp未根除還是再感染的有效工具。成熟的PCR技術(shù)除了可應(yīng)用胃及口腔等部位的消化道標本的檢測外，還可用于體外標本，為解決Hp的傳播途徑等問題作出貢獻。

這一大類方法最大的缺點，或者說受到的限制是必需通過胃鏡取標本。除了消毒不嚴密，胃鏡檢查本身就是一種傳播Hp感染的媒介以外，胃鏡檢查還能造成胃病患者額外增加一些損傷與痛苦。一般來講患者都是在迫不得已的情況下才接受這一檢查的。因此更不宜在短期內(nèi)重復用于抗Hp療效的考核上。而且做胃鏡的費用亦較貴，若不是為了初診的需要，只是為了考核抗Hp療效，普遍再去做胃鏡檢查，顯然是不適宜的。

4.1.2非侵襲性診斷方法

國際上是指非通過胃鏡取活檢標本診斷Hp標本感染的方法.這類方法包括血清學和同位素蹤兩大類。

血清學方法 是根據(jù)Hp感染者血清中出現(xiàn)相應(yīng)的抗體而設(shè)計的。血清中的IgM與IgA亦均能檢測到，但其臨床意義均不如IgG明顯。因此目前最常用的是以ELISA方法測血清中的IgG，或者再加上IgA。這在市場上已有藥盒供應(yīng)。由于各家廠商所用的抗原種類不同。所定的標準又不統(tǒng)一，因此結(jié)果參差不齊。若用全菌或粗制抗原，由于與空腸彎曲菌存在共同抗原，敏感性可能較高，但特異性較差。若用第三代精制抗原（測Hp的尿素酶或外膜蛋白等)特異性較高，但敏感性可能會削弱一些。由于患者抗體一旦產(chǎn)生后，會持續(xù)相當長時間。因此Hp的血清學反應(yīng)陽性表明此人必定感染過Hp，或者此人目前還可能在感染中。但是由于胃中Hp經(jīng)治療后已被殺滅，血清中IgG不可能一下子降下來，還可持續(xù)6～12個月，因此血清抗體測定一般不適宜用作抗Hp療效的監(jiān)測。

采取胃液用ELISA法測分泌型IgA，亦是一種可采用的血清學方法。但其實際意義未見有更大優(yōu)越性，因此未獲得廣泛采用。最近國外還有人提出用ELISA法測唾液中IgA。若后者方法上趨于成熟，結(jié)果可靠，將是一種較有前途的方法。

同位素蹤方法 這一類方法是基于Hp尿素酶能把尿素分解成CO₂和NH₃，根據(jù)用不同的同位素標記在尿素的C原子或N原子上，然后讓被試者口服一定量的標記尿素，定時收集呼出的氣體或排出的尿，檢測其中標記CO₂和NH₃的排出率，即可準確地反映Hp在胃中的存在。由此，產(chǎn)生了三種不同的試驗。用¹³C標記的稱作¹³CO₂，呼氣試驗，用¹⁴C標記的¹⁴CO₂呼氣試驗。這兩種試驗方法與作用類同，只是¹³C只是穩(wěn)定性同位素，檢測儀器需用質(zhì)譜儀，但目前已可用光譜儀檢測。¹⁴C是放射性同位素，可用液體閃爍掃描儀檢測。¹⁴C是一種半衰期長達5000余年的放射性同位素。對被檢測者有可能造成長期的內(nèi)照射損傷，是一種不宜推廣應(yīng)用的方法。更不宜用于孕婦及兒童，在成人中重復應(yīng)用亦應(yīng)極其謹慎。1992年我國學者吳繼瓊等人在國際上首創(chuàng)了用穩(wěn)定性同位素¹⁵N標記的尿素作¹⁵NH₄⁺排出試驗（后又改稱¹⁵N排出試驗)。這一種試驗原理與作用與¹³CO₂呼氣試驗相同，無放射性損傷。所不同的是搜集的標本不同，前者搜集的是尿樣，后者搜集的是呼出氣體。目前國際上普遍認為¹³CO₂呼氣試驗是監(jiān)測抗Hp療效的最佳方法。其優(yōu)點：可無損傷地及時地反映胃內(nèi)的實際感染情況，敏感性特異性較高，可克服活檢標本因Hp感染灶在胃壁分布不勻可能造成的假陰性結(jié)果，甚至孕婦兒童都能重復使用。尿¹⁵N排出試驗與¹³CO₂呼氣試驗一樣，目前由于涉及設(shè)備與費用總是，暫時還難于推廣。

4.2 Hp感染的治療

Hp感染現(xiàn)在主要靠抗Hp藥物進行治療。盡管Hp在體外對許多抗菌藥物都很敏感，但是在體內(nèi)用藥并不那樣如意。這是因為Hp主要寄生在粘液層下面，胃上皮細胞表面。注射途徑用藥，對它無作用，經(jīng)口局部又因為胃酸環(huán)境．粘液層的屏障及胃的不斷排空作用，使藥效也大大地受到了限制。再加上有些藥長期應(yīng)用易產(chǎn)生嚴重的副作用或耐藥菌株等問題。因此Hp感染引起的急慢性胃炎．消化性潰瘍等疾病，本來看起來很容易治療的問題，實際上效果并不總是很理想。何況目前缺乏合適的Hp感染的動物模型，可供幫助制訂有效的治療方案。因此目前的治療方案幾乎全憑臨床經(jīng)驗制訂，有很大的局限性（因地區(qū)、人群的差異)�？偟闹v來，目前不提倡用單一的抗菌藥物，因為它的治愈率較低，一般＜20％，且易產(chǎn)生耐藥性。

治療方案的選擇原則是：①采用聯(lián)合用藥方法；②Hp的根除率＞80%，最好在90％以上；③無明顯副作用，病人耐受性好；④病人經(jīng)濟上可承受性。判斷Hp感染的治療效果應(yīng)根據(jù)Hp的根除率，而不是清除率。根除是指治療終止后至少在一個月后，通過細菌學、病理組織學或同位素示蹤方法證實無細菌生長。

目前國內(nèi)外常用的抗Hp藥物有羥氨芐青霉素、甲硝唑、克拉霉素、四環(huán)素、強力霉素、呋喃唑酮、有機膠態(tài)鉍劑（De-Nol等)等。潰瘍病患者尚可適當結(jié)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑或H2受體拮抗劑加上兩種抗菌素，或者質(zhì)子泵抑制劑（如奧美拉唑)加上一種抗菌素。療程一般為兩個星期。由于治療Hp感染抗菌方案的廣泛應(yīng)用，有可能擴大耐藥性問題的產(chǎn)生。因此，將來替換性的治療或預防策略，如疫苗預防或免疫治療的研究是值得重視的。

4.3 Hp感染的流行病學

慢性胃炎患者的胃粘膜活檢標本中Hp檢出率可達80%～90%，而消化性潰瘍患者更高，可達95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局部上皮細胞已發(fā)生異化，因此檢出率高低報道不一。在自然人群中初出生的新生兒血清中抗Hp-IgG水平卻很高，接近成人水平，可能從母體獲得被動免疫抗體之故。半年后迅速下降。在我國及大多數(shù)發(fā)展中國家中陽性率待降至10%～20%后又迅速回升。大約在10歲以后即迅速上升達到或接近成人陽性檢出率水平。人群Hp感染率因國家因地區(qū)有所不同。低達20%，高達90%。人群中總感染率高于發(fā)達國家。這些基本資料說明了如下幾個問題。①胃病患者中Hp檢出率遠高于人群中總的檢出率，這說明Hp感染者并不都得胃病。這可能還蘊藏著與致病有關(guān)的其他因素，特別是遺傳因素（宿主的易感性和菌株的型別差異等)。②人群中的Hp感染率與胃病的發(fā)生率，發(fā)展中國家高于發(fā)達國家。這又與社會經(jīng)濟、衛(wèi)生狀況有關(guān)。特別是現(xiàn)已證明胃癌高發(fā)區(qū)不僅與該地區(qū)人群中Hp感染率高有關(guān)外，還與人群中Hp的早發(fā)感染有關(guān)。③人類一旦感染Hp后，若不進行治療，幾乎終身處于持續(xù)感染中。因此感染率總的講來隨著年齡增長而增長。

關(guān)于傳染源問題：自然人群中Hp感染率是如此之高，因此是人類Hp感染的主要傳染源應(yīng)該是毫無疑問的�，F(xiàn)在的問題是除了人類以外是否還有其他的傳染源。在非人的靈長類動物——某些猴類、鼬鼠、貓狗等動物的胃中，亦曾分離到Hp。因此有人認為Hp感染也是動物源性傳染病。關(guān)于這一點當然不能絕對排除。但是作為傳染源來講這些動物的機會是非常少的，因為人群與這些動物直接接觸的機會是不多的（當然屬寵物的除外)。

按理Hp是上消化道寄生菌，再加上人群感染率是如此之高，使人們很容易想到其主要傳播途徑必定是糞—口途徑無疑�？墒侵钡饺缃窕畹腍p由糞便排出未找到有力的證據(jù)。幾年前有一位英國學者報告成功地自糞便中分離到Hp，但是其他學者均未重復成功。近年來許多人都是用PCR來證實糞中Hp的存在，結(jié)果亦很不一致。有的說糞中陽性率很高，有的說即便在胃中已證實有Hp感染者，糞便中亦未出現(xiàn)陽性。因此糞便中是否有Hp的典型菌，圓球體或殘留的HpDNA排出仍是一個謎�？墒菑挠幸恍┤说�牙菌斑及齲齒中分離到Hp，為Hp的經(jīng)口傳播提供了一些證據(jù)。另外由于消毒不嚴，由胃鏡引起的醫(yī)源性傳播亦已得到證實。上海市醫(yī)務(wù)人員中Hp感染的血清學調(diào)查表明從事消化內(nèi)窺鏡工作的醫(yī)護人員的Hp感染率明顯高于其他醫(yī)務(wù)人員。這也可以說是因密切接觸后可能造成間接口—口傳播的一個證據(jù)。

盡管Shahamate等證明Hp能在人工模擬河水的微生態(tài)環(huán)境中長期存在。并證明在實驗室條件下4°C河水中能存活10d。但是迄今未有人從自然環(huán)境中分離到Hp。然而Klein等發(fā)現(xiàn)胃癌發(fā)病率比南美洲高4倍的非洲Lima的普魯（Peru)族人中，用¹³CO₂呼氣試驗發(fā)現(xiàn)2～12歲兒童中Hp感染者用外源性飲用水（井水)的比用內(nèi)源性飲用水（自來水)的高3倍。Hulten等進一步對Lima附近一個小鎮(zhèn)的飲用水作了研究。他們從Lima取回冰凍水源，用抗Hp-IgG包裹的免疫磁性微球濃縮Hp。用Hp粘附素亞單位基因PCR和Hp約16s rRNa RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄酶PCR)兩種分子生物學手段去檢測水源中有無Hp的DNA。結(jié)果24/48份標本粘附素亞單位PCR陽性，而11/48份標本兩種檢測方法均為陽性。因此，他們認為普魯人飲用水中出現(xiàn)Hp與兒童中流行病學的高發(fā)結(jié)果是一致的。這為某些條件下可能發(fā)生Hp的水源性傳播提供了證據(jù)。

5 GHLOs與Hp感染的動物模型

5.1 GHLOs

胃螺桿菌樣細菌（Gastric Helicobacter likeorganisms GHLOS)是指人胃中發(fā)現(xiàn)的Hp以外的在某些性狀上類似Hp的細菌，自從1989年Goodwin提出另立Helicobacter一屬以來，先后已有許多學者報告了10余種GHLOs，至少包括有雪貂中的H.mustelae(Hm)，大鼠和小鼠中的H.muridarum，貓、狗中的H.felis(Hf),卷尾猴中的H.nemetrinae，獵豹中的H.acinonyx，狗中的H.canis和H.bizzozero，小鼠中的H.hepaticus等。另外有人把原屬彎曲菌屬的有些細菌，亦歸入此屬。例如H.cinaedi、H.fenneliae和H.heilmanii 。還有人把流產(chǎn)羔羊中分離到的Flexispira rappini，后來在人胃腸類病人中亦發(fā)現(xiàn)此菌，且其尿素酶基因與Hp相似，因此亦歸入此屬，稱作H.rappini。這些GHLOs中一部分可能是人或動物胃中的寄生菌，另一部分可能是人或動物胃中的寄生菌，另一部分可能是人或動物胃以外下消化道中的寄生菌。因此它們的生物學性狀及致病性等千差萬別。除了Hm和Hf以外，目前尚缺少系統(tǒng)的比較資料。

5.2 Hp感染的動物模型

Hp與Hp感染的許多問題的深入解決，尚有待于找到合適的動物模型。但是要建立一個理想的Hp感染動物模型，又是很困難的事。近十年來人們作了很多努力。最早人們用各種常規(guī)實驗動物作Hp感染均未成功。1987年Krakowka以GF（Germ-free)級小豬用Hp感染，最早建立了悉生（Knotobiotic)動物模型。后來又有人用SPF（Specific-pathogen-frees)級小獵兔犬建立了悉生動物模型，條件非常困難，耗費又大，一般情況下很難辦到。因此有人企圖用小鼠大鼠等小動物取代之。但直接用Hp感染均未成功，因此人們轉(zhuǎn)而企圖用GHLOs（Hf,Hm)在小鼠中建立模擬人類Hp感染的模型。1990年Lee等首先用Hf接種GF級的Swiss Webster小鼠建立了模擬的人類急慢性胃炎的動物模型。后來bhskgw.cn/wsj/Karita用BalB/c裸鼠直接感染Hp獲得成功。但是裸鼠是一種免疫缺陷型動物，把它用作Hp正常感染情況的研究也有很大缺陷。Fox曾建議用雪貂作動物模型。因為成年的雪貂幾乎100%感染了Hm。盡管GHLOs在某些特征上類似于Hp，用它做Hp感染的動物模型能說明一些問題。但GHLOs總終是GHLOs，不能完全代替Hp。裸鼠雖能感染Hp，由于免疫缺陷，亦使其實際應(yīng)用受到局限。Dubois等又建議用自然感染Hp的族群內(nèi)繁殖的猴群作Hp感染模型.但這種猴群又往往同時感染有Gastrospillum hominis�？傊�，十余年來一直未能找到一種十分滿意的Hp感染動物模型。最近，Marchetti等用Hp直接感染了CD1和BalB/c，小鼠獲得了成功。看來，他們成功的經(jīng)驗在于，Hp原來對這些小鼠的致病力是非常弱的，由于重復通過了這些小鼠，使其致病力有所提高才得以感染。

6 展望

Hp的發(fā)現(xiàn)可以說對胃、十二指腸病學的發(fā)展產(chǎn)生了一個劃時代的影響。近十余年來胃、十二指腸病因?qū)W的觀念發(fā)生了根本的改變，新建立了一系列的侵襲性的和非侵襲性的涉及微生物、病理學、免疫學、生物物理學和分子生物學診斷Hp感染的方法。對急、慢性胃炎及消化性潰瘍疾病的治療改用抗Hp為主的治療方針后，已取得了良好效果，潰瘍的復發(fā)率已大大下降。在胃癌與MALT淋巴瘤的發(fā)生中也看到了Hp感染在其中起著重要作用，這為今后預防這些腫瘤指明了努力的方向。對Hp本身的生物學性狀及其致病機制也已越來越清楚。這些是十余年來取得的巨大進展。然而目前也還存在著一些問題。例如：診斷中最可靠最基礎(chǔ)的細菌分離培養(yǎng)工作尚未能普及。準確性較高的非侵襲性¹³CO₂呼氣試驗及尿¹⁵N排出試驗等由于涉及設(shè)備條件，費用較貴等原因不易推廣�？焖倌蛩孛冈囼灱把�清學診斷制劑等市場上供應(yīng)的藥盒，種類繁多，缺少統(tǒng)一標準，有的甚至未經(jīng)過嚴格鑒定即上市，給臨床診斷上造成了混亂。分子生物學方法，亦因種類很多，需要有一定的技術(shù)條件，因此還在研究試用階段，尚未成熟到能普及給臨床作出準確診斷的程度。因此，診斷方法的不斷改進完善，仍然是不能忽視的一面。慢性胃炎與消化性潰瘍由于廣泛采用了抗Hp方針為主的治療后，不可避免地帶來越來越嚴重的毒副作用和耐藥性問題。因此，除了不斷總結(jié)經(jīng)驗，改進治療方案以外，探討免疫治療的可能性及挖掘祖國醫(yī)學中的偉大寶庫亦是一些值得重視的方面。Hp在自然人群中感染的面是如此之廣，其涉及的疾病，除了胃癌是我國腫瘤死亡位居第二的病因外，影響廣大人民身體健康及勞動生產(chǎn)力的程度也是極其嚴重的。研究一種像卡介苗一樣，能有效地從嬰幼兒時期開始即預防這些疾病的疫苗的研究任務(wù)已經(jīng)放在我們面前。希望我們有志者能來突破這一堡壘，為人類作出貢獻。當然還有一些問題。例如：Hp感染的傳播途徑仍需進一步搞清楚。致病機制尚需經(jīng)合適的動物模型的考核。GHLOs需要好好整理一下，哪些是毫不相干的等等。當前首先一個重要的問題是我們要把Hp的有關(guān)知識盡快普及給人民群眾，讓每家每戶都知道：胃病是因傳染了Hp后引起的，目前唯一有效的簡易辦法是講究衛(wèi)生，防止“病從口入”，特別是做家長的從嬰幼兒出生后即開始注意這一點。若能做到這一點，待有效地疫苗到來之前，我們就已可能從兒童開始減少一大批Hp感染者，大大減少各種胃病的發(fā)生率。

張振華

上海第二醫(yī)科大學微生物學教研室（200025)

圖6 Hp圓球體掃描電鏡（×20000)

圖7 Hp鉆入壁細胞的分泌小管中超薄切片，透射電鏡（×8000)

Hp：幽門螺桿菌

st:分泌小管

圖8 Hp密集地粘附于胃上皮細胞表面超薄切片，透射電鏡（×8000)

圖9 Hp與Le^bRBC發(fā)生的凝集現(xiàn)象超薄切片透射電鏡（×12000)

Hp：幽門螺桿菌

Leb：lewisb型紅細胞