四、顯色反應(yīng)
黃酮類化合物的顯色反應(yīng)多與分子中的酚羥基及γ-吡喃酮環(huán)有關(guān)。
(一)還原試驗
1.鹽酸-鎂粉(或鋅粉)反應(yīng)
它是鑒定黃酮類化合物最常用的顯色反應(yīng)。多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅至紫紅色，少數(shù)顯紫至藍(lán)色，當(dāng)B-環(huán)上有-OH 或-OCH3取代時，呈現(xiàn)的顏色亦即隨之加深。但查耳酮、橙酮、兒茶素類則無該顯色反應(yīng)。異黃酮類化合物除少數(shù)例外，也不顯色。
2.四氫硼鈉(鉀)反應(yīng)
在黃酮類化合物中，NaBH4對二氫黃酮類化合物專屬性較高，可與二氫黃酮類化合物反應(yīng)產(chǎn)生紅至紫色。其他黃酮類化合物均不顯色，可與之區(qū)別。
(二)金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)
黃酮類化合物分子中常含有下列結(jié)構(gòu)單元：三羥基四羰基，四羰基五羥基，鄰二酚羥基，故�？膳c鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽等試劑反應(yīng)，生成有色絡(luò)合物。
1.鋁鹽
常用試劑為1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液。生成的絡(luò)合物多為黃色(λmax=415nm)，并有熒光，可用于定性及定量分析。
2.鋯鹽
多用2%二氯氧化鋯甲醇溶液。黃酮類化合物分子中有游離的3-或5-羥基存在時，均可與該試劑反應(yīng)生成黃色的鋯絡(luò)合物。但兩種鋯絡(luò)合物對酸的穩(wěn)定性不同。3-羥基，4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性比5-羥基，4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性強(但二氫黃酮醇除外)。故當(dāng)反應(yīng)液中加入枸櫞酸后，5-羥基黃酮的黃色溶液顯著褪色，而3-羥基黃酮溶液仍呈鮮黃色(鋯-枸櫞酸反應(yīng))。
3.鎂鹽
常用乙酸鎂甲醇溶液為顯色劑，本反應(yīng)可在紙上進行。二氫黃酮、二氫黃酮醇類可顯天藍(lán)色熒光，若具有C3-OH，色澤更為明顯。而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃至橙黃乃至褐色。
4.氯化鍶(SrCl2)
在氨性甲醇溶液中，氯化鍶可與分子中具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物生成綠色至棕色乃至黑色沉淀。
5.三氯化鐵
三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑。多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基，故可產(chǎn)生陽性反應(yīng)，但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時，才呈現(xiàn)明顯的顏色。
(三)硼酸顯色反應(yīng)
當(dāng)黃酮類化合物分子中有下列結(jié)構(gòu)時，在無機酸或有機酸存在條件下，可與硼酸反應(yīng)，生成亮黃色。顯然，5-羥基黃酮及2′-羥基查耳酮類結(jié)構(gòu)可以滿足上述要求，故可與其他類型區(qū)別。一般在草酸存在下顯黃色并具有綠色熒光，但在枸櫞酸-丙酮存在的條件下，則只顯黃色而無熒光。
(四)堿性試劑顯色反應(yīng)
1.二氫黃酮類易在堿液中開環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的異構(gòu)體——查耳酮類化合物，顯橙至黃色。
2.黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣瑩?jù)此可與其他黃酮類區(qū)別。
3.黃酮類化合物的分子中有鄰二酚羥基取代或3,4′-二羥基取代時，在堿液中不穩(wěn)定，易被氧化，出現(xiàn)黃色→深紅色→綠棕色沉淀。
第三節(jié) 提取與分離
一、提取
黃酮苷類以及極性稍大的苷元(如羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、查耳酮等)，一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑進行提取。其中用得最多的是甲醇-水(1：1)或甲醇。一些多糖苷類則可以用沸水提取。在提取花青素類化合物時，可加入少量酸(如0.1%鹽酸)。但提取一般黃酮苷類成分時，則應(yīng)當(dāng)慎用，以免發(fā)生酸水解反應(yīng)。為了避免在提取過程中黃酮苷類發(fā)生水解，也可按常規(guī)提取苷的方法事先破壞酶的活性。大多數(shù)黃酮苷元宜用極性較小的溶劑，如用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取，而對多甲氧基黃酮的游離苷元，甚至可用苯進行提取。
對得到的粗提取物可進行精制處理，常用的方法有：
(一)溶劑萃取法
根據(jù)黃酮類化合物極性的大小分別萃取。一般的黃酮苷元可以選擇氯仿或者乙醚進行萃取，單糖苷可以選擇乙酸乙酯進行萃取，多糖苷可以選擇水飽和的正丁醇來萃取。
(二)堿提取酸沉淀法
堿提取酸沉淀法對有酸性的游離的黃酮苷元都是合適的，因為游離的黃酮苷元具有親脂性，由于有酚羥基顯酸性，因此可以溶解在堿水中，當(dāng)用堿水提取后，再加入酸，能夠恢復(fù)為原來的游離的狀態(tài)，具有親脂性，在酸水中不溶解而形成沉淀。
黃酮苷類雖有一定極性，可溶于水，但卻難溶于酸性水，易溶于堿性水，故可用堿性水提取，再將堿水提取液調(diào)成酸性，黃酮苷類即可沉淀析出。此法簡便易行，如蘆丁、橙皮苷、黃芩苷的提取都采用了這個方法。
在用堿酸法進行提取純化時，應(yīng)當(dāng)注意所用堿液濃度不宜過高，以免在強堿性下，尤其加熱時破壞黃酮母核。在加酸酸化時，酸性也不宜過強，以免生成 鹽，導(dǎo)致析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。當(dāng)藥材中含有大量果膠、黏液等水溶性雜質(zhì)時(如花、果類藥材)，宜用石灰乳或石灰水代替其他堿性水溶液進行提取，以使上述含羧基的雜質(zhì)生成鈣鹽沉淀，不被溶出。這將有利于黃酮類化合物的純化處理。
(三)炭粉吸附法
主要適于黃酮苷類的精制，大部分黃酮苷類可用7%酚-水洗下。洗脫液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后，再用乙醚振搖除去殘留的酚，余下水層減壓濃縮即得較純的黃酮苷類成分。
二、分離
(一)柱色譜法
分離黃酮類化合物常用的吸附劑或載體有硅膠、聚酰胺、葡聚糖凝膠及纖維素粉等。
1.硅膠柱色譜
此法應(yīng)用范圍最廣，按照黃酮類化合物極性的大小先后洗脫，達到分離的目的。主要適于分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇及高度甲基化(或乙醚化)的黃酮及黃酮醇類。
2.聚酰胺柱色譜
對分離黃酮類化合物來說，聚酰胺是較為理想的吸附劑。其吸附強度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。聚酰胺柱色譜可用于分離各種類型的黃酮類化合物，包括苷及苷元、查耳酮與二氫黃酮等。黃酮類化合物從聚酰胺柱上洗脫時有下述規(guī)律：
(1)苷元相同，洗脫先后順序一般是：叁糖苷，雙糖苷，單糖苷，苷元。
(2)母核上增加羥基，洗脫速度即相應(yīng)減慢。
(3)不同類型黃酮化合物，先后流出順序一般是：異黃酮，二氫黃酮醇，黃酮，黃酮醇。
(4)分子中芳香核、共軛雙鍵多者易被吸附，故查耳酮往往比相應(yīng)的二氫黃酮難于洗脫。
3.葡聚糖凝膠(Sephadex gel)柱色譜
對于黃酮類化合物的分離，主要用兩種型號的凝膠：Sephadex-G型及Sephadex-LH20型。用葡聚糖凝膠分離黃酮類化合物的機理是：
分離游離黃酮時，主要靠吸附作用。凝膠對黃酮類化合物的吸附程度取決于游離酚羥基的數(shù)目，數(shù)目越多，越難洗脫。但分離黃酮苷時，則分子篩的性質(zhì)起主導(dǎo)作用。在洗脫時，黃酮苷類大體上是按分子量由大到小的順序流出柱體。
(二)pH梯度萃取法
pH梯度萃取法適合于酸性強弱不同的黃酮苷元的分離。根據(jù)黃酮類苷元酚羥基數(shù)目及位置不同其酸性強弱也不同的性質(zhì)，可以將混合物溶于有機溶劑 (如乙醚)后，依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH溶液萃取，來達到分離的目的。一般規(guī)律大致如下：
7,4′-二羥基酸性最強，可以溶于5%NaHCO3，其次是含有7或4′-羥基可以溶于5%Na2CO3，然后是含有一般酚羥基可以溶于0.2%NaOH溶液中，最后是含有5-羥基只能溶解在4%NaOH溶液中。
(三) 根據(jù)分子中某些特定官能團進行分離
在黃酮類成分的混合物中，具有鄰二酚羥基的成分與無此結(jié)構(gòu)的成分，性質(zhì)不同，可以進行分離。
1.鉛鹽沉淀法
有鄰二酚羥基的成分可被乙酸鉛沉淀，不具有鄰二酚羥基的成分可被堿式乙酸鉛沉淀，據(jù)此可將兩類成分分離。
2.硼酸絡(luò)合法
具有鄰二酚羥基的黃酮可與硼酸絡(luò)合，生成物易溶于水，借此也可與不具上述結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物相互分離。
第四節(jié) 鑒別與結(jié)構(gòu)測定
一、色譜法在黃酮類化合物鑒別中的應(yīng)用
1.紙色譜(PC)
適用于分離各種天然黃酮類化合物及其苷類的混合物�；旌衔锏蔫b定常采用雙向色譜法。以黃酮苷類為例來說，一般第一向展開采用某種醇性溶劑，如 n-BuOH-HAc-H2O(4：1：5上層，BAW)，主要是根據(jù)分配作用原理進行分離醫(yī)學(xué)全.在.線.提供. bhskgw.cn。第二向展開溶劑則用水或水溶液，如2%～6%HAc。主要是根據(jù)吸附作用原理進行分離。
黃酮類化合物的苷元中，平面性較強的分子如黃酮、黃酮醇、查耳酮等，用含水類溶劑如3%～5%HAc展開時，幾乎停留在原點不動(Rf<0.02);而非平面性分子如二氫黃酮、二氫黃酮醇、二氫查耳酮等，因親水性較強，故Rf值較大(0.10～0.30)。
黃酮類化合物分子中羥基苷化后，極性即隨之增大，故在醇性展開劑中Rf值相應(yīng)降低，同一類型苷元，Rf值依次為：苷元>單糖苷>雙糖苷。但在用水或2%～8%HOAc，3%NaCl水溶液或1%HCl展開時，則上列順序?qū)嵉�，苷元幾乎停留在原點不動，苷類的Rf值可在0.5以上，糖鏈越長，則Rf值越大。
2.硅膠薄層色譜
用于分離與鑒定弱極性的黃酮類化合物較好。分離黃酮苷元常用的展開劑是甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5：4：1)，并可以根據(jù)待分離成分極性的大小適當(dāng)?shù)卣{(diào)整甲苯與甲酸的比例。
3.聚酰胺薄層色譜
適用范圍較廣，特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類。由于聚酰胺對黃酮類化合物吸附能力較強，因而需要用可以破壞其氫鍵締合的溶劑作為展開劑。在大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。
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