一、細(xì)胞和組織
免疫組織化學(xué)技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷和研究疾病的目的。抗原的準(zhǔn)確顯示和定位與制備的細(xì)胞和組織標(biāo)本質(zhì)量的好壞有著密切的聯(lián)系。由于各種抗原的生化、物理性質(zhì)不同，如溫度高低、酸堿度強(qiáng)弱及各種化學(xué)試劑的作用均可影響抗原的免疫學(xué)活性，良好的細(xì)胞和組織學(xué)結(jié)構(gòu)將有助于抗原的準(zhǔn)確定位。因此，細(xì)胞和組織標(biāo)本的采集制備在免疫組織化學(xué)技術(shù)中占有十分重要的位置。
�。ㄒ�)細(xì)胞標(biāo)本的取材
目前，免疫組化技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)診斷，如鑒別低分化癌與惡性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA應(yīng)用于胸腹水中間皮瘤與癌的鑒別。McAb應(yīng)用于淋巴白血病和惡性淋巴瘤的分類分型。近年來(lái)，培養(yǎng)細(xì)胞的免疫組化技術(shù)在鑒定細(xì)胞的種類、分化程度、表面抗原特點(diǎn)以及腫瘤結(jié)構(gòu)成分改變等方面的研究均起到了積極作用。
細(xì)胞標(biāo)本的取材有以下3種方法:
1．印片法
主要應(yīng)用于活組織檢查標(biāo)本和手術(shù)切除標(biāo)本。新鮮標(biāo)本以最大面積剖開(kāi)，充分暴露病變區(qū)，將載玻片輕輕壓于病變區(qū)，脫落的細(xì)胞便粘附在玻片上，立即浸入細(xì)胞固定液內(nèi)5-10min，取出后自然干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?/P>
優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便省時(shí)，細(xì)胞抗原保存較好。缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻，玻片上細(xì)胞重疊，影響標(biāo)記效果。
2．穿刺吸取涂片法
主要應(yīng)用于實(shí)質(zhì)器官的病變區(qū)，如肝、腎、肺、淋巴結(jié)、軟組織等。用細(xì)針穿刺吸取病變區(qū)內(nèi)液體成分，如穿刺液較少，可直接涂抹在載玻片上，力求細(xì)胞分布均勻。如穿刺液較多，細(xì)胞豐富，可用洗滌法：將穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（RPMi 1640液)的試管內(nèi)，輕輕攪拌，以500rpm低速離心5-10min后，棄上清液，將沉淀制成細(xì)胞懸液（濃度約2×106細(xì)胞/ml)，吸取1滴于載玻片上，輕輕涂抹，待涂片略干即可固定。
該法穿刺吸取直接涂片的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞形態(tài)保持較好。缺點(diǎn)是細(xì)胞分布不均勻。洗涂法片雖可彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，但操作復(fù)雜，細(xì)胞常常發(fā)生變形。
3．體液沉淀涂片法
主要用于胸水、腹水、尿液、腦脊液等體液多、細(xì)胞少的標(biāo)本。體液采取后，必須及時(shí)處理，更不宜加固定液。根據(jù)標(biāo)本內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少選用不同的處理方法：①細(xì)胞數(shù)量極多者，可吸取少量液體直接涂在玻片上。②細(xì)胞數(shù)量較少者，可將液體自然沉淀，然后吸取5ml左右沉淀液，以1500rpm離心10min，棄上清液，將沉淀涂片，略干后固定備用。
如用細(xì)胞離心涂片器(Cytospin )，可將標(biāo)本用上述離心沉淀法制成2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，吸取50μl加入涂片器內(nèi)，離心后即制成分布均勻的細(xì)胞涂片，細(xì)胞分布在直徑約6mm的小圓圈內(nèi)，每個(gè)圓圈內(nèi)的細(xì)胞數(shù)約105個(gè)(Danos,1976)。
培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)本的取材可根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞特性分別采取不同的方法。某些細(xì)胞有貼壁生長(zhǎng)的特性，如纖維母細(xì)胞、粘液癌細(xì)胞等，只需將載玻片或蓋玻片插入培養(yǎng)液內(nèi)即可收集到理想的細(xì)胞標(biāo)本。某些細(xì)胞只能在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，可用上述體液沉淀離心涂片法處理。
制備細(xì)胞涂片應(yīng)注意：①標(biāo)本反復(fù)離心洗滌，細(xì)胞的粘附性降低，在免疫組化染色過(guò)程中容易脫片，因此，在制備涂片前載玻片上應(yīng)涂粘附劑。②為節(jié) 省試劑和便于鏡下觀察和記數(shù)，應(yīng)將細(xì)胞集中到直徑0.6-1.0cm的圓圈內(nèi)，細(xì)胞總數(shù)以105個(gè)為宜。③粘液豐富的標(biāo)本，如痰液，胃液等，未經(jīng)特殊處理，一般不宜作免疫組化標(biāo)記。
�。ǘ�)組織標(biāo)本的取材
組織標(biāo)本主要取之于活組織檢查標(biāo)本、手術(shù)切除標(biāo)本、動(dòng)物模型標(biāo)本以及尸體解剖標(biāo)本等。前三者均為新鮮組織，后者是機(jī)體死亡2h以上的組織，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有變性消失，嚴(yán)重彌散現(xiàn)象，因此，尸檢組織應(yīng)盡快固定處理，以免影響免疫組化標(biāo)記效果。但有些較穩(wěn)定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸檢標(biāo)本中，抗原顯示仍較好。
組織標(biāo)本的取材常常受到各種因素的影響，如各種內(nèi)窺鏡鉗取的組織，常因過(guò)度擠壓而變形，嚴(yán)重者組織結(jié)構(gòu)被破壞。大組織標(biāo)本病變分布廣泛，抗原在組織中分布不均一，常出現(xiàn)人為的組織取材不準(zhǔn)確。為了避免上述缺點(diǎn)，組織取材時(shí)應(yīng)注意：①活檢鉗的刃口必須鋒利，以免組織受擠壓；②取材部位必須是主要病變區(qū)；③必須取病灶與正常組織交界區(qū)；④必要時(shí)取遠(yuǎn)距病灶區(qū)的正常組織作對(duì)照。
為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后慶立即作處理，或立即速凍成凍塊進(jìn)行冰凍切片，或立即用固定液固定進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片。如不能迅速制片，可貯存于液氮罐內(nèi)或-70。C冰箱內(nèi)備用。
二、細(xì)胞和組織的固定
�。ㄒ�)固定
為了更好的保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，有必要對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行固定。固定的作用不僅是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，更重要的是最大限度的保存細(xì)胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖�，防止抗原彌散。醫(yī)學(xué) 全在.線提供www.med126.com
不同抗原，其穩(wěn)定性也不相同，因而對(duì)固定劑的耐受性差異較大。如T淋巴細(xì)胞表面抗原屬不穩(wěn)定性抗原，對(duì)固定劑的耐受較差，抗原活性容易喪失。而HBsAg屬穩(wěn)定性抗原，其抗原活性很少受固定劑種類、固定時(shí)間、溫度等因素的影響。
（二)固定劑
用于免疫組織化學(xué)的固定劑種類較多，性能各異，在固定半穩(wěn)定性抗原時(shí)，尤其重視固定劑的選擇，介紹如下。
1．醛類固定劑
雙功能交聯(lián)劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，保存抗原于原位，其特點(diǎn)是對(duì)組織穿透性強(qiáng)，收縮性小。有人認(rèn)為它對(duì)IgM、IgA、J鏈、K鏈和λ鏈的標(biāo)記效果良好，背景清晰，是常用的固定劑。
�。�1)10%鈣-福爾馬林液（濃甲醛10ml，飽和碳酸鈣90ml)。
�。�2)10%中性緩沖福爾馬林液（濃甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml)。
�。�3)4%多聚甲醛磷酸緩沖液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，兩者混
合加熱至60℃，攪拌并滴加1n NaOH至清晰為止，冷卻后加PBS液至總量1000ml)。
（4)戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，濃甲醛10ml，蒸餾水加至100ml)。
戊二醛是二醛基化合物，交聯(lián)結(jié)合力比甲醛大，Bullock認(rèn)為交聯(lián)過(guò)強(qiáng)，可出現(xiàn)組織改變和空間遮蔽現(xiàn)象，影響組織的抗原性。但McDonald等認(rèn)為，該試劑用于PAP法免疫酶標(biāo)記效果仍滿意。
�。�5)甲醛升汞固定液（即B5固定液。濃甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸鈉1.25g ,蒸餾水90ml)。
有人認(rèn)為此固定液懸液是較理想的固定液，標(biāo)記IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人認(rèn)為它減弱細(xì)胞的抗原性，上皮細(xì)胞可產(chǎn)生非特異性熒光，故不宜用于免疫熒光標(biāo)記。氯化汞是一種強(qiáng)蛋白凝固劑，但對(duì)組織穿透性弱，且使組織收縮，故與甲醛混合使用。
�。�6)醋酸-甲醛液（濃甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理鹽水加至100ml)。
Bullock等認(rèn)為此液固定效果良好，組織可不經(jīng)消化，胞漿IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J鏈標(biāo)記均呈陽(yáng)性，且背景染色極淡。如標(biāo)記IgG用PAP法第一抗體僅為甲醛升汞液的1/10。此液內(nèi)醋酸既可防止組織收縮，又可暴露胞漿免疫球蛋白抗原決定簇。
�。�7)Bouin’s液。
該固定液為組織學(xué)、病理學(xué)常用固定劑之一，對(duì)組織穿透力較強(qiáng)而收縮性較小，比單獨(dú)醛類固定更適合免疫組化染色。Kayhko認(rèn)為用于標(biāo)記B細(xì)胞的J鏈較好，但Bullock則認(rèn)為它可導(dǎo)致Igg γ重鏈變性，故必需加大第一抗體的濃度。
�。�8)Zamboni’s液。
該固定液可用于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于純甲醛，也適用于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究。采用2.5%多聚甲醛和30%飽和苦味酸，更可增加對(duì)組織穿透力和固定效果，以保存更多的組織抗原。固定時(shí)間6-18h。
�。�9)PLP液（過(guò)碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液)。
該固定劑適用于富含糖類的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。其機(jī)制是過(guò)碘酸氧化組織中的糖類形成醛基，通過(guò)賴氨酸的雙價(jià)氧基與醛基結(jié)合，從而與糖形成交聯(lián)。組織抗原大多數(shù)是由蛋白質(zhì)和糖兩部分構(gòu)成，抗原決定簇位于蛋白部分，故該固定液有選擇性地使糖類固定，既穩(wěn)定缺的，又不影響其在組織中的位置（固定劑7-9配制法見(jiàn)附錄1)。
2．非醛類固定劑Pe等人比較幾種非醛類雙功能試劑指出，碳化二亞胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亞胺、和對(duì)苯醌等均適用于多肽類激素的組織固定，單獨(dú)使用時(shí)，邊緣固定效應(yīng)重，但與戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明顯改善。
�。�1)碳化二亞胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI)液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于標(biāo)記多肽類激素的組織，對(duì)標(biāo)記IgA、IgG效果不佳。
�。�2)碳二亞胺-戊二醛液（ECD-G液)：配制法見(jiàn)附錄一。
ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide Hydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亞胺鹽酸鹽，簡(jiǎn)稱乙基-CDI。
該液常用于多肽類激素的固定，對(duì)酶等蛋白質(zhì)固定效果良好，對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原定位，超微結(jié)構(gòu)保存好，是一種培養(yǎng)細(xì)胞電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究的良好固定劑。
�。�3)Zenker’s 液（重鉻酸鉀2.5g,氯化汞5g,硫酸鈉1g,蒸餾水100ml,混合溶解后，臨用時(shí)加水醋酸5ml)。
該固定液對(duì)免疫球蛋白染色最佳，固定時(shí)間約2-4h，染色前必須脫汞色素。
