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| 實驗二十二 標準曲線的制作及回收試驗 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【實驗?zāi)康摹?/p> 在生物化學與分子生物學實驗過程中，常常需要對生物樣品中某種物質(zhì)的含量進行測定。通過制作待測物質(zhì)在一定測定條件下的標準曲線，可十分方便快捷地進行樣品中物質(zhì)含量的大批量測定。同時，為了了解生物樣品中其他物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，可通過回收試驗來判斷。本實驗以鄰甲苯胺法測定血液樣品中葡萄糖含量為例，通過糖標準曲線的制作及回收試驗的操作，綜合性訓練學生掌握標準曲線的制作以及對大批量生物樣品中物質(zhì)含量進行準確測定的技術(shù)方法。 【實驗原理】 1. 標準曲線的制作原理 配制一系列已知不同濃度的測定物標準溶液，按樣品測定同樣的方法處理顯色，分別測得它們的光密度，再以光密度為縱坐標，濃度為橫坐標，在方格坐標紙上作圖，所得的曲線即標準曲線。 制作標準曲線的意義在于：①作為較正曲線，從濃度-光密度的直線特性，可判斷某一測定方法中化學反應(yīng)產(chǎn)生的顏色物質(zhì)是否符合bhskgw.cn/wszg/或遵守Lambert-Beer定律。②可判斷在操作過程中，操作、儀器等誤差的大小，從而確定方法的可靠性。③作為工作曲線，在大量進行樣品中測定物含量分析時，通常用作計算的基礎(chǔ)，即從曲線上可直接找到測定液的光密度所相當?shù)臐舛取?/p> 2. 回收試驗原理 在分光光度測定法中，測定液除含待測物質(zhì)外，還含有許多非測定成份而與標準液的測定結(jié)果不一致。這些成份是否影響顯色反應(yīng)并引起測定誤差，可借回收試驗來檢查。即在待測樣品中加入已知濃度的標準物質(zhì)，再按樣品測定的條件和方法進行顯色及測定，然后計算所測出的標準物質(zhì)的含量占加入標準物質(zhì)量的百分率，這種操作稱為回收試驗，以回收率(%)表示。 回收率愈接近100%，說明樣品中非測定成份對測定結(jié)果的影響愈小，結(jié)果愈準確可靠�；厥章室嗫煞从掣蓴_物質(zhì)存在與否、影響程度如何以及這種影響與濃度有無關(guān)系；還可檢查操作誤差和儀器誤差。一般認為回收率達到100±5%即較為理想。 3. 血糖含量測定（鄰甲苯胺法)原理 葡萄糖在熱醋酸溶液中與鄰甲苯胺（ortho-toluidine)縮合生成藍綠色的希夫堿（Schiff base)，其顏色深淺與葡萄糖含量成正比；與同樣處理的葡萄糖標準溶液進行分光光度測定（或根據(jù)其光密度查標準曲線)，可求得待測血液樣品中葡萄糖的含量。正常人血糖含量為3.89~5.56 mmol/L。 4. 臨床意義 血糖超過正常最高值，稱為高血糖癥，常由糖尿病、甲狀腺機能亢進、腦垂體前葉機能亢進、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)機能亢進等疾病引起。血糖低于正常最低值，稱為低血糖癥，多見于胰島素分泌過多、腎上腺皮質(zhì)機能減退、腦垂體前葉機能減退、甲狀腺機能減退等。
【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 鄰甲苯胺試劑：稱取硫脲（thiourea，A.R.)2.5 g，溶于冰乙酸（glacial acetic acid，A.R.)750 mL中。將此溶液轉(zhuǎn)移入1 L容量瓶內(nèi)，加鄰甲苯胺（ortho-toluidine)150 mL, 2.4% 硼酸（boric acid)溶液100 mL，再加冰乙酸至1 L刻度，置棕色瓶中，至少可應(yīng)用兩個月。 ⑵ 葡萄糖貯存標準液（50mmol/L)：將少量無水葡萄糖（A.R.或C.P.)置于硫酸干燥器內(nèi)一夜。精確稱取此葡萄糖0.900 g，以飽和苯甲酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移入100 mL容量瓶內(nèi)，再以飽和苯甲酸溶液稀釋至100 mL刻度。置冰箱中可長期保存。 ⑶ 葡萄糖應(yīng)用標準液（1.25mmol/L)：準確吸取葡萄糖貯存標準液2.5 mL，置100 mL容量瓶內(nèi)，以飽和苯甲酸溶液稀釋置100 mL刻度。 ⑷ 飽和苯甲酸溶液：稱取苯甲酸（benzoic acid)2.5 g，加入蒸餾水1 L中，煮沸使溶解，冷后貯存于試劑瓶中。 2. 器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 刻度吸量管。 ⑶ 水浴鍋。 ⑷ 722型分光光度計。 ⑸ 方格坐標紙。 【實驗步驟】 1. 操作 取潔凈干燥的試管8支，編號，按下表操作：
混勻后置沸水浴中加熱15分鐘。取出，用冷水冷卻；用波長630nm進行比色，以空白管校正光密度到零點，讀取各管光密度，并記錄之。 2. 結(jié)果與計算 ⑴ 計算：列公式并計算出測定管的葡萄糖含量（選擇與測定管光密度值接近的標準管進行計算)，單位為mmol/L。 ⑵ 作圖：將以上各標準管光密度為縱坐標，相應(yīng)的各標準管葡萄糖濃度（依次相當于1.25mmol/L，2.5mmol/L，3.75mmol/L，5.0mmol/L，6.25mmol/L)為橫坐標，在坐標紙上作圖，繪成標準曲線。 ⑶ 從標準曲線上查出血清葡萄糖含量，并與計算的結(jié)果進行比較。 ⑷ 回收率計算：列公式并計算回收管的葡萄糖含量（選擇與回收管光密度值較接近的標準管光密度值進行計算)，單位為mmol/L。 回收率(%) = 回收量(mmol/L)/加入量(mmol/L) × 100% 注：回收量(mmol/L)= 回收管葡萄糖含量(mmol/L)－ 測定管葡萄糖(mmol/L) 本實驗中加入量為2.5 mmol/L。 【實驗注意事項】 1. 在保證取量準確的前提下，所使用的不同規(guī)格的吸量管或移液器應(yīng)盡可能少。 2. 為保證測定值的精確性，可設(shè)定平行管并取平均值。 【思考題】 1. 如何制作標準曲線？制作標準曲線時有哪些注意事項？標準曲線的何用途？ 2. 為什么要進行回收試驗？其原理是什么？ 3. 怎樣計算回收率？ 4. 鄰甲苯胺法測定血糖的原理是什么？ 5. 血糖的正常值是多少？有何臨床意義？
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