臨床基礎(chǔ)檢驗學(xué):第一章　一般性操作技術(shù)

第一節(jié)　血液標(biāo)本的采集和處理

血液標(biāo)本的采集是分析前質(zhì)量控制的重在環(huán)節(jié)，可分為毛細(xì)血管采血法和靜脈采血法。需要血量較少的檢驗，如手工法或半自動血細(xì)胞分析儀血細(xì)胞計數(shù)，常用毛細(xì)管采血法。需血量較多檢驗，如紅細(xì)胞比積、臨床生化檢驗、全自動血細(xì)胞分析血細(xì)胞計數(shù)一般用靜脈采血法。特別是全自動血細(xì)胞分析儀，無論儀器進(jìn)樣品多少，為防止血樣中小凝塊的形成，保證儀器進(jìn)樣時標(biāo)本能充分混勻，原則上均應(yīng)使用靜脈血。毛細(xì)血管血和靜脈血之間，無論細(xì)胞成分或化學(xué)組成，都存在程度不同的差異。在判斷和比較所得結(jié)果時必須予以考慮。

某些生理因素，如吸煙、進(jìn)食、運(yùn)動和情緒激支等，均可影響血液成分。甚至一日之間，白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對值、淋巴細(xì)胞各亞群的比例等參數(shù)均有一定的波動。服用某些藥物可能明顯干擾實驗，得出假象結(jié)果。因此采血時，應(yīng)詢問濁否服用過明顯干擾試驗的藥物（如阿司匹林對血小板聚集的抑制作用)關(guān)盡可能在一定時間在避免干擾因素條件下進(jìn)行，以便于比較和動態(tài)分析。

一、毛細(xì)血管采血法

成人常用手指或耳垂采血。耳垂采血痛較輕，操作方便，適用于肥復(fù)采集，特別是手指皮膚粗厚者，但耳垂外周血循環(huán)較差，血細(xì)胞容易停滯，受氣溫影響較大，檢查結(jié)果不夠恒定。紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞比積結(jié)果均比靜脈血高，特別是冬季小波動幅度更大。手指采血操作方便�？色@較多血量。嬰幼兒手指太小可用拇指或足跟采血。嚴(yán)重燒傷患者，可選擇皮膚完整處采血，采血器以用帶帶三棱針或?qū)Ｓ玫摹安裳�針”為好，特別是后者有利于采血技術(shù)的質(zhì)量控制，為了避免交叉應(yīng)嚴(yán)格實行一人一針制。應(yīng)注意穿刺的深度的適當(dāng)，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗結(jié)果。

二、靜脈采血法

幾位于體表的淺靜脈均可作為采血部位，通常采用肘部靜脈，肘部靜脈不明顯時，可用手背靜脈或內(nèi)踝靜脈。幼兒可于頸外靜脈采血。根據(jù)采血量可選用不同型號注射器配血相應(yīng)的針頭。某些特殊的檢查，比臺血小板的激活，要使用塑料注射器和硅化處理后的試管或塑料閉幕式管。采血前應(yīng)向病人作適當(dāng)解釋，以消除不必要的疑慮和恐懼。如遇個別病人采血后發(fā)生暈厥，可讓其平臥，通常休息片刻即可恢復(fù)。必要時可嗅芳香氨酊，針刺或指掐人中，合谷等穴位。止血帶壓迫時間不難過長，歸好不超過半分鐘，以避免瘀血和血液濃縮，有試驗證明，壓迫時間過長，可引起纖溶活性增強(qiáng)，血小板釋放及甘些因子活性增強(qiáng)，影響某些實驗結(jié)果。注射器和容器必須干燥，抽血時避免產(chǎn)生大量泡沫，向血后應(yīng)先拔針頭，然后將血液徐徐注入標(biāo)本容器。否則可能導(dǎo)致溶血。溶血標(biāo)本不僅紅細(xì)胞半數(shù)，紅細(xì)胞比積降低，血漿清化學(xué)組成也會產(chǎn)生變化，影響鉀、鎂、轉(zhuǎn)氨酶等多項指標(biāo)的測定。有些試驗需用具有嚴(yán)密寒緊的，潔凈的橡膠或塑料寒子的玻璃或塑料管作采血及儲存器。目前國外已經(jīng)普及（國內(nèi)已開始生產(chǎn))的封閉式真空采血器，既有利于標(biāo)本的收集運(yùn)送和保存，又便于防止血液交叉感染，已開始在國內(nèi)推廣使用。

血液標(biāo)本的保存條件非常重要，不適當(dāng)保存直接影響實驗結(jié)果。文獻(xiàn)報導(dǎo)，既便將血漿放在4。C冰箱內(nèi)保存，24小時后的因子活性也僅為采血后即刻實驗結(jié)果的5%（減少95%)，而供血液分析儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)的血液只能在室溫下保存，低溫保存可使血小板計數(shù)結(jié)果減低。因此，應(yīng)根據(jù)實驗項止確定最佳的保存條件。

三、抗凝劑

抗凝劑種類很多，性質(zhì)各異，必須根據(jù)檢驗止的適當(dāng)選擇，才能獲得預(yù)期的結(jié)果�，F(xiàn)將實驗常用抗凝劑及其使用方法簡述如下：

1、乙二胺四乙酸（EDTA)鹽 EDTA有二鈉、二鉀和三鉀鹽。均可與鈣離子結(jié)全成螯合物，從而阻止血液凝固。

Na₂C₁₀H₁₄O₈N₂+C_A²⁺→C_AC₁₀H₁₂O₈N₂+2N_A⁺+2H⁺

EDTA鹽經(jīng)100⁰C烘干，抗凝作用不變，通常配成15g/L水溶液，每瓶0.4ml，干燥后可抗凝5ml血液。EDTA鹽對紅、白細(xì)胞形態(tài)影響很小，根據(jù)國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)公委員會（International committee standard of hematology ,ICSH)1993年文件建議，血細(xì)胞計數(shù)用EDTA二鉀作抗凝劑，用量為EDTA-K2。2H2O1.5-2.2Mg （4.45±0.85μmol)/ml血液。EDTA-NA與EDTA-K2對血細(xì)胞計數(shù)影響均較小，但二鈉溶解度明顯低于二鉀，有時影響抗凝效果，其他抗凝劑不適合于血細(xì)胞計數(shù)。表1-1是幾種抗凝劑對白細(xì)胞計數(shù)的影響，EDTA影響小板聚集，不適合于作凝血象檢查和血小板功能試驗。

表1-1 不同抗凝劑不同條件保存血液的WBC變化（×10⁹/L)

2.枸椽酸鈉（trisodiumcitrate)枸椽酸鹽可與血中鈣離子形成可溶性螯合物，從而阻止血液凝固。

2N_a3C₆H₅O₇+2C_A²⁺→2C_AC₆H₅O₇^-+6N_a⁺

枸椽酸鈉有2Na₃C₆H5_O7。和2N_a3C₆H_5。11H₂O等多種晶體。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液（也有用106mmol/l濃度)，與血液按1：9或1：4比例使用。枸椽鈉對凝血V因子有較好的保護(hù)作用，使其活性減低緩，故常用于凝血象的檢查，也用于紅細(xì)胞沉降率的測定。因毒性小，是輸積壓保養(yǎng)中的成分之一。

由于枸椽酸鈉溶液是按體積肥比例加入血液內(nèi)達(dá)到抗凝目的的，而抗凝劑主要是作用于積壓漿成分，通常所謂的1：9比例抗凝的概念是提1份體積的抗凝劑作用9份紅細(xì)胞比積正常血液內(nèi)的血漿成分而言。所以臺果對貧血或紅細(xì)胞增多癥患者的血液仍按1：9的比例加入抗凝劑時，就會發(fā)生抗凝劑足或相對過多，這將明顯地影響凝象檢查結(jié)bhskgw.cn/job/果。為了避免這種現(xiàn)象，有文獻(xiàn)報道應(yīng)根據(jù)抗凝劑用量（ml)=0.00185×血量×（100—病人紅細(xì)胞比積%)這一公式，來計算抗凝劑的用量。

3．草酸鈉（sodiumoxalate)草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固。

草酸鈉通常用0.1mol/L濃度，與血液按1：9比例使用，過去主要用于凝務(wù)象檢查。實踐發(fā)現(xiàn)草酸鹽對凝備V因子保護(hù)功能差，影響凝血酶原時間測定效果；另外由于草酸鹽與鈣結(jié)合形成的是沉淀物，影響自動凝血儀的使用，因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為凝積壓象檢查選用枸椽酸鈉為抗凝劑更為適宜。

4．肝素（heparin)肝素廣泛在于肺、肝、脾等幾乎所有組織和血管周圍肥大細(xì)胞和暑堿性粒細(xì)胞的顆粒中。它是一種含硫酸基團(tuán)的粘多糖，是分散物質(zhì)，平均分子量為15000（2000-40000)。肝素可加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ)滅活絲氨酸蛋白酶，從而具有阻止凝血酶形成，對抗凝血酶和阻止血小板聚集等多種作用。每毫升血液抗凝需要持素15±2.5Iu 。盡管肝素可以保持紅細(xì)胞的自然形態(tài)，但由于其�？梢�起白細(xì)胞聚集關(guān)使用涂片在羅氏（)染色時產(chǎn)生藍(lán)色背景，因此肝素抗凝血不適全血液學(xué)一般檢查。肝素是紅細(xì)胞透滲脆性試驗理想的抗凝劑。

第二節(jié)　血涂片的制備和細(xì)胞染色

血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細(xì)胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。比臺觀察10個高倍視野血涂片中白細(xì)胞和血小板數(shù)大致估計血內(nèi)這些細(xì)胞的數(shù)量，借以作為儀器結(jié)果分析后質(zhì)控的參考。

但積壓涂片制備和染色不良，常使細(xì)胞鑒別發(fā)生困難，甚至導(dǎo)致錯誤結(jié)論。例如，血膜過厚細(xì)胞重疊縮小，血膜太薄白細(xì)胞多集中于邊緣，細(xì)胞分布不勻；染色偏酸或偏堿均可使細(xì)胞染色反應(yīng)異常。因皮制備厚薄適宜，分布均勻，染色良好的血涂片是血液學(xué)檢查的重要革本技術(shù)之一。

血涂片制備方法及注意事項將在實習(xí)指導(dǎo)中詳細(xì)介紹。

1．瑞特（Wright)染色法：為發(fā)觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，識別各種細(xì)胞及其異常變化，血涂片必須嘲行染色。血涂片的各種染色方法大多是羅氏染色法衍變來的。目前常用瑞特染色法。

（1)瑞特染料是由酸性染料伊紅和堿性染料亞甲藍(lán)組成有復(fù)合染料。亞甲藍(lán)為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)。美藍(lán)容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍(lán)中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。即伊紅和伊混合后，產(chǎn)生一種憎液性膠體伊紅美藍(lán)中性沉淀，即瑞特染料。

（2)細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。

（3)PH對細(xì)胞染色有影響。細(xì)胞各種成分均不蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下在電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏三性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用正經(jīng)片必須清潔，無酸堿污染。配制頊特液必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。

bhskgw.cn/rencai/新鮮配制的染料偏堿，須在室溫或是37℃下貯存一定時間，待染料成熟，主要是美藍(lán)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆后才能使用，貯存時愈久，染色效果愈好。EAm GILLILAND等采用吸光度比值作為頊特染液的質(zhì)量規(guī)格。rA測定方法如下：取瑞特染液15-25μl（視染液濃度而定)，加甲醇10ml稀釋，混勻后以甲醇為空折管，分別以波長650nm和25nm比色。Ra=a650/a525.因為美藍(lán)吸收峰小組長為650nm，伊紅吸收峰波長為525nm ;天青B吸收峰也為650nm但吸光度A約為美藍(lán)的一半。所以新配染料rA接近2，隨著美藍(lán)逐漸氧化為天青B，RA也相應(yīng)下降。RA下降到1.3±0.1時即可使用。瑞特染液貯存過程中，必須塞嚴(yán)，以防止甲醇揮發(fā)和被氧化成甲酸。有人主張在配方中加入甘油30ml，防止甲醇揮發(fā)，關(guān)可合細(xì)胞染色清晰。甲醇必須純凈，如甲醇中丙酮含量過多，染色偏酸，使白細(xì)胞著色不良。

2．吉姆薩（Giemsa)染色法：吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。但本法對細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min�；蛳扔萌鹛厝旧�法染色后，再用稀釋吉姆薩復(fù)染。