實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié)　核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、核酸的化學(xué)組成

組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量約為15%～16%，磷含量為9%～10%。由于核酸分子中的磷含量比較恒定，因此，核酸定量測(cè)定的經(jīng)典方法，是以測(cè)定磷含量代表核酸量。

核酸經(jīng)水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本單位，核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多核苷酸，核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷還可進(jìn)一步水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿。因此，核酸是由含氮堿、戊糖及磷酸三種成分組成。

含氮堿（簡(jiǎn)稱堿基)：核酸中的含氮堿簡(jiǎn)稱堿基，是嘌呤堿（purine)與嘧啶堿（pyrimidine)的衍生物。RNA和DNA含有的共同堿基成分是腺嘌呤（adeninwww.med126.come,A)、鳥嘌呤（guanine,G)和胞嘧啶（cytosine, C)。二者的區(qū)別是RNA含有尿嘧啶（uracil,U)，而DNA含有胸腺嘧啶（thymine,T)。嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互變異構(gòu)現(xiàn)象，一般生理pH條件下呈酮式。它們的結(jié)構(gòu)如下：

有些核酸中含有修飾堿基（或稀有堿基)，這些堿基大多是在上述嘌呤或嘧啶堿的不同部位甲基化（methylation)或進(jìn)行其它的化學(xué)修飾而形成的衍生物。例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶（m⁵C)，5-羥甲基胞嘧啶（hm⁵C)。某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤（m¹A)、2，2-二甲基鳥嘌呤（m₂²G)和5，6-二氫尿嘧啶（DHU)等。

嘌呤堿和嘧啶堿一般多不易溶于水，對(duì)250～280nm波長的紫外光有較強(qiáng)的吸收，但對(duì)260nm光波的吸收能力最大。由于堿基是核酸的基本組成成分，因此，所有的核酸（包括DNA和RNA)其共同特點(diǎn)是對(duì)260nm處的紫外光有最大的吸收值。

核酸分子中堿基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等，所以可根據(jù)核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來測(cè)定核酸量。一般以每升核酸溶液中含1g磷原子為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算核酸的吸光率，這稱為克原子磷吸光率或克原子磷消光系數(shù)[ε（p)],ε(p)的計(jì)算式為：

ε（p)=A/Cl

A為吸光度（光密度)，1為比色杯內(nèi)徑，通常為1.0cm；C為每升核酸溶液中磷的克原子數(shù)。

C= 每升溶液中磷重（wg)/30.98ε(p)=30.98A/wl

一般DNA的ε（p)=6000～8000;RNA為7000～10000

現(xiàn)將DNA和RNA的化學(xué)組成歸納如表18-1：

表18-1

二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸又稱多核苷酸，組成DNA的脫氧核糖核苷酸主要為四種，即dAMP、dGMP、dCMP及dTMP；組成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP四種。對(duì)兩種核酸的組成可簡(jiǎn)寫如下：

DNA=（堿基-脫氧核糖-磷酸)n；RNA=（堿基-核糖-磷酸)n

核酸中核苷酸的連接方式為：一個(gè)核苷核C-3’上羥基與下一個(gè)核苷核酸C-5’連接在磷酸羥基脫水縮合成酯鍵，稱酯鍵稱3’5’磷酸二酯鍵，若干個(gè)核苷酸間依3’5’磷酸二酯鍵連接成長鏈的大分子即為核酸。此長鏈稱多核苷酸鏈，在鏈的一核苷酸，其C-5’連接的磷酸只一個(gè)酯鍵，稱此核苷酸為鏈的5’磷酸未端或5’。鏈的另一端核苷酸上C-3’上羥基是自由的，對(duì)此核苷酸稱為3’羥基末端或3’端，鏈內(nèi)的核苷酸在C-5’上磷酸已形成二酯鍵，C-3’上羥基也已參與二酯鍵的形成，故稱核苷酸殘基。

核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)乃指其核苷酸鏈中核苷酸的排列順序，由于核酸中核苷酸彼此之間的差別乃在于堿基部分，故核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)即指核酸分子中堿基的排列順序。

對(duì)核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的描述為：將5’磷酸末端書于左側(cè)，中間部分為核苷酸殘基，3’羥基末端書于右側(cè)。通常用豎線表示核糖，堿基標(biāo)于豎線上端，豎線間有含P的斜線，代表3’,5’磷酸二酯鍵。此表示法及簡(jiǎn)化式如下：

三、核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸的多核苷酸鏈在次級(jí)鍵的基礎(chǔ)上，還可形成更為復(fù)雜的二級(jí)及三級(jí)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

（一)DNA

1．二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年Watson 及Crick在化學(xué)分析及X光衍射法觀察DNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double helix model)此結(jié)構(gòu)是在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的更為復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，即DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)如圖18-1。

圖18－1　DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

P：磷酸基；S：脫氧核糖；G：鳥嘌呤；

A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶C：胞嘧啶

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)，其內(nèi)容可歸納為：

（1)DNA分子為二條多核苷酸鏈以一共同軸為中心，盤繞成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋直徑2nm。螺旋盤繞形成鏈間的兩種溝，即寬的大溝與狹窄的小溝。

（2)二條多核苷酸鏈的走向相反，通常取左側(cè)鏈從上到下為5’→3’端，右則鏈從下向上為5’→3’端，這樣二條鏈構(gòu)成反平行排列的雙螺旋。

（3)二條多核苷酸鏈借氫鍵而連系在一起。氫鍵乃一鏈堿基上-NH₂的氫與另一鏈上堿基的氧或氮形成。堿基有二個(gè)氫鍵，G與C之間有三個(gè)氫鍵（圖18-3)。這種相配關(guān)系稱為堿基互補(bǔ)或堿基配對(duì)。配對(duì)的堿基處于同一平面，此平面與雙螺旋的中心軸垂直，由于二條鏈中堿基互補(bǔ)，所以二鏈彼此又稱為互補(bǔ)鏈。

（4)堿基對(duì)之間氫鍵的能量為3～7kcal/mol，由于氫鍵多，所以可維系DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。另外堿基對(duì)彼此間距離為0.34nm,每一螺旋含10個(gè)堿基對(duì)，故螺距為3.4nm，相鄰堿基對(duì)間彼此尚有范德瓦士（van der Waals)力作用（此力量為1～2kcal/mol,作用范圍為0.5nm)，能量雖弱但由于堿基對(duì)多，合力也就大�？梢妷A基對(duì)的氫鍵及堿基對(duì)之間的范德瓦士力是穩(wěn)定DNA成雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要能量。

上述DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是溶液及活體中常見的形式，通稱B型。當(dāng)B型所處條件的濕度低于75%時(shí)，可轉(zhuǎn)變?yōu)锳型。A型的堿基對(duì)不垂直于雙bhskgw.cn/rencai/螺旋的軸、傾斜約20度，螺距降為2.8nm，每一螺旋含11個(gè)堿基對(duì)。B型與A型的水合程度不同，它們是DNA分子在天然條件下的兩種基本形式。除A、B型外尚發(fā)出有C型雙螺旋，似B型，螺距3.3nm，第一螺旋含9個(gè)堿基對(duì)。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)闡明的量重要意義在于第一次提出了遺傳信息是以DNA分子中核苷酸的排列順序?yàn)閮?chǔ)存方式，從而說明了天然遺傳信息的復(fù)制過程。

2．三級(jí)結(jié)構(gòu)已發(fā)現(xiàn)線粒體、葉綠體、細(xì)菌、質(zhì)粒及一些病毒的DNA雙螺旋分子尚可形成封閉環(huán)狀，天然狀態(tài)的環(huán)狀DNA分子多扭曲成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)（superhelix)，這些比螺旋更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)即DNA分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

真核生理細(xì)胞核中的DNA具有一種超螺旋結(jié)構(gòu)，即DNA雙螺旋盤繞在組蛋白上形成核小體（nucleosome)。核小體是染色質(zhì)（chromatin)的核心小粒，由有140個(gè)堿基對(duì)的雙螺旋DNA纏繞于由組蛋白（H2A、H2B、H3及H4各二分子)組成的八聚體外面，這一DNA股由此形成直徑為9nm的超螺旋1.75圈。此核小體又經(jīng)60個(gè)堿基對(duì)的DNA雙螺旋及組蛋白H1形成細(xì)絲（間隔區(qū))與下一個(gè)核小體相連接。

核小體的DNA雙螺旋為200個(gè)堿基對(duì)，長度應(yīng)為0.34nm×200=68nm，但實(shí)際長度只10nm，說明DNA雙螺旋鏈進(jìn)一步螺旋化盤繞在組蛋白八聚體上，其長度壓縮了7/8。每6個(gè)核小體又繞成一圈形成螺線管，外徑為30nm，螺距為10nm。這樣DNA分子長度被壓縮了6/7。120個(gè)螺線管又盤繞成直徑為400nm，高為30nm的超螺線管，DNA分子長度又被壓縮了40/41，此超螺線管即染色體的單位纖維（unit fiber)，長20～60nm。從單位纖維形成染色單體（chromatid)，實(shí)際長度為2～10nm，DNA分子長度又被壓縮了5/6～6/7。這樣從許多核小體組成的串珠樣纖維經(jīng)多層次螺旋化結(jié)構(gòu)到形成染色單體，DNA分子的長度已被壓縮至近1/10000。

（二)RNA

RNA分子也是由核苷酸依3’,5’磷酸二酯鍵形成的多核苷酸鏈。RNA總是以單鏈的形式存在，也有5’磷末端及3’羥基末端。RNA單鏈的局部折疊成的某一片段的A及G分別與另一片段的U及C配對(duì)常形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure)。在此結(jié)構(gòu)內(nèi)的堿基無需全部配對(duì)，而配對(duì)部位形成小的雙螺旋區(qū)域，不能配對(duì)的堿基則連成小環(huán)從螺旋區(qū)中被圈出來。這種RNA單鏈局部小雙螺旋結(jié)構(gòu)即是RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

四、基本組織

由于DNA分子中核苷酸序列分析以及一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的研究，使得人們有可能進(jìn)一步了解DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因組織的關(guān)系。已經(jīng)證實(shí)，自然界極大多數(shù)生物體遺傳信息貯存在DNA的核苷酸排列順序中，因此，基因是DNA的一個(gè)片段，只有少數(shù)病毒的遺傳信息貯存在RNA分子中。DNA分子中不同區(qū)域有不同功能，有些區(qū)域可編碼蛋白質(zhì)（最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì))，有些區(qū)域可編碼RNA（最終產(chǎn)物是tRNA和rRNA)，有些序列則與調(diào)控有關(guān)。那么一個(gè)DNA分子能攜帶多少基因呢？如果以平均1000個(gè)堿基對(duì)可編碼一個(gè)3kD的蛋白質(zhì)計(jì)算，猴病毒（SV₄₀)DNA分子量為3.0×10⁵，有5000堿基對(duì)可編碼5種蛋白質(zhì)。人染色體DNA有2.3×10⁹堿基對(duì)，可編碼200萬以上的基因，但實(shí)際上，最多可編碼基因數(shù)為2～3萬。這是由于真核細(xì)胞DNA分子除編碼蛋白質(zhì)和RNA等結(jié)構(gòu)基因外，有相當(dāng)部分DNA順序?qū)儆诜蔷幋a區(qū)，而原核細(xì)胞DNA由于分子較小，必需充分利用有限的核苷酸序列。各種生物體內(nèi)DNA分子的大小見表18-2。

表18-2 各種生物體內(nèi)DNA分子的大小

1.真核生物的基因組織根據(jù)某一段核苷酸順序在整個(gè)DNA分子中出現(xiàn)的頻率不同可分為以下幾種：

（1)單拷貝順序（singlecopy sequence)：在整個(gè)DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。除組蛋白、角蛋白和肌動(dòng)蛋白以外，幾乎所有的蛋白質(zhì)基因都是單拷貝順序，平均為1000堿基對(duì)。單拷貝基因在整個(gè)基因組織中所占比例最高。在人的細(xì)胞中約占DNA含量的一半。

（2)中等重復(fù)順序（moderatelyrepetitive sequences)：有些基因如核蛋白體RNA基因、tRNA基因、組蛋白基因等在DNA分子中可重復(fù)出現(xiàn)幾十到幾千次，約占人細(xì)胞DNA含量的30～40%。以rRNA為例，在大腸桿菌中重復(fù)頻率為7而果蠅中可重復(fù)千次�？梢娬婧思�(xì)胞中重復(fù)順序比原核細(xì)胞高得多。

（3)高重復(fù)順序（highlyrepetitive sequences)：可重復(fù)幾百萬次。往往是簡(jiǎn)單的重復(fù)順序，如蟹的T-A-T-A-T-A-T。也有的較長如非洲綠猴DNA是以172個(gè)堿基對(duì)的順序?yàn)榛�礎(chǔ)重復(fù)幾萬次。高重復(fù)順序一般位于異染色質(zhì)上，多數(shù)不編碼蛋白質(zhì)或RNA，其功能還不太清楚，主要是起間隔作用，可能與調(diào)控有關(guān)。

在重復(fù)順序中還有一種反轉(zhuǎn)重復(fù)順序（inverted repetitivesequences)。其特點(diǎn)是一段堿基呈現(xiàn)回文結(jié)構(gòu)，即一條單鏈回折即可形成互補(bǔ)的雙鏈，故稱為回文結(jié)構(gòu)（palindromicstructure)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure)。這種結(jié)構(gòu)對(duì)基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄可能具有調(diào)節(jié)　控制功能。

真核細(xì)胞中單拷貝順序和重復(fù)順序常常是中間隔排列的。不僅如此，在一個(gè)基因內(nèi)部往往被一個(gè)或幾個(gè)額外的順序分割成若干片段，這種插入到基因內(nèi)部的順序稱為插入順序或內(nèi)含子（intron)。內(nèi)含子是不編碼的順序，而編碼的堿基順序則稱為外顯子（exon)。插入順序是真核細(xì)胞DNA最主要的特征。

真核生物由于存在著較多的重復(fù)順序、特殊的插入順序以及控制區(qū)和其它多余順序，使得DNA總長度往往大于編碼的結(jié)構(gòu)基因，因此，實(shí)際基因數(shù)往往小于DNA分子。

2．原核生物的基因組織原核生物DNA分子較小，基因組織也較簡(jiǎn)單，一般具有以下特點(diǎn)：

（1)DNA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼部分（又稱間隔區(qū))通常包含控制基因表達(dá)的順序。例如，噬菌體фX174中只有5%是非編碼區(qū)。

（2)功能相關(guān)的基因常常串聯(lián)在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA分子中，稱為多順序反子。這種現(xiàn)象在真核生物中是很少見的。

（3)基因重疊：例如фX174的E基因全部包括在D基因內(nèi)，B基因則包括在查基因內(nèi)。這種現(xiàn)象主要發(fā)現(xiàn)在病理DNA分子中，可能是由于DNA分子太小又要裝入相當(dāng)量的基因的緣故。