實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　在研究和診斷自身免疫性疾病中的應用

在自身免疫性疾病的診斷中，目前常常用免疫細胞化學技術檢查相應的自身抗體作為重要診斷依據之一，并以此探討自身免疫性疾病發(fā)生的免疫機理。

用免疫熒光法可以檢查的自身抗體日益增多，具有器官特異性的自身抗體如甲狀腺球蛋白抗體和甲狀腺微粒體抗體，甲狀腺第二膠質抗體，腎上腺抗體，胃壁細胞抗體，皮膚表皮間粘合質（Intercellular Cement of epidermis)抗體和基底細胞層抗體，唾液腺導管細胞抗體，胰島細胞抗體，腎小球基底膜抗體，結腸粘膜上皮多糖物質抗體，精子抗體，卵巢抗體，胃G細胞抗體等。

用免疫熒光法可以檢查出的非器官特異性自身抗體，有抗核抗體，平滑肌抗體，線粒體抗體、橫紋肌抗體、神經髓鞘（外周)抗體、抗網狀纖維抗體等。

還有報告用免疫熒光法檢查血細胞自身抗體如抗白細胞（淋巴細胞)、紅細胞，血小板抗體等。

一、抗核抗體（Antinuclearantibodies, ANA)的檢測

Friou等（1957)首先用免疫熒光法檢查出存在于SLE病人血清中的NAN，Alexander和Duthie（1958)證實了Friou等的結果。Friou等（1958)檢查了28例SLE病人血清中有27例ANA陽性。一例陰性屬臨床長期不活動性病人。以后大量報告都指出用免疫熒光間接法檢查ANA對于臨床診斷SLE有重要價值，其陽性率在80%～100%之間，陽性對于SLE病有確診價值，但陰性不能完全排除SLE，因為少數(shù)活動性SLE其ANA可能維持陰性，F(xiàn)essel氏認為可能是一種亞型。正常人0%～4%，類風濕關節(jié)　炎、皮肌炎、硬皮病、sjogeren’s綜合征，混合性結締組織病、慢性活動性肝炎等多種疾病也呈不同程度的ANA陽性率，ANA可能是一種自身免疫反應的一個重要指標。ANA在各種疾病中的百分率見表15-1。

表15-1 抗核抗體在各種疾病中的百分率

Hargraves對狼瘡細胞（1948)已進行了大量的研究，證明引起狼瘡細胞發(fā)生的因子，為抗核成分的抗體�？购丝贵w是一組對細胞核內DNA，RNA或組蛋白、或這些物質的分子復合物的自身抗體，目前發(fā)現(xiàn)至少有十七種。這些抗核抗體對于結締組織病的致病病因的探討和臨床診斷均有重要幫助。這些結締組織病各有不同的抗核抗體譜（Antinuclear Antibodies profile)。

目前，國內已建立了11種測定方法，提高了結締組織病的診斷水平。

用作檢查ANA的抗原很多，如雞的紅細胞核，人白細胞，皮膚，甲狀腺、脾臟、淋巴瘤、胸腺、腎、羊膜細胞、頰細胞等，還有Hela細胞，大小白鼠的肝和腎冰凍切片（4～6μm)等，以成年小白鼠的肝切片最為常用。用動物細胞核作抗原，可以避免血型的干擾因素。Konice氏等（1978)報告用馬疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum, TE)作抗原測定SLE病人血清中抗雙鏈DNa （dsDNA)因TE的核和動基體為不含蛋白的純dsDNA，抗原性純一，特異性強，不需提純，為天然的dsDNA底物，據認為抗dsDNA抗體為SLE所特有，一些研究指出dsDNA抗體與SLE病情活動及狼瘡腎炎的發(fā)病機理有密切關系，持續(xù)高滴度的抗dsDNA抗體是狼瘡腎炎的不祥之兆。

1．抗核抗體的熒光形態(tài)及臨床意義ANA的熒光形態(tài)和其相應抗原有密切關系，ANA的抗原性質和自身免疫性疾病有關，所以，觀察熒光形態(tài)與臨床診斷可能有一定聯(lián)系。

（1)周邊型（或稱核周型)：可見熒光以核邊緣強，核輪鮮明，靠核膜的熒光呈絨毛狀，核中心熒光弱或無。這是天然DNA或去氧核糖蛋白的抗體產生的一種熒光形態(tài)，肝細胞核，腎小管上皮細胞核和雞紅細胞核較典型。常見于活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血清中。藥物引起的狼瘡樣綜合征也常出現(xiàn)。這些病人病情嚴重，腎受累的約占56%，與疾病進行性發(fā)展和狼瘡細胞現(xiàn)象密切相關。

（2)均質型（或稱彌散型)：可見全核呈均勻一致的黃綠色熒光，核輪廓明確。血清中這種抗體用脫氧核糖蛋白吸收可以消除。證明是由核蛋白抗體（主要是IgG類)與核中脫氧核糖蛋白反應的結果。此種熒光形態(tài)常見于活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人，偶見于惡性病或結締組織病。滴度多在1：160以上。如將血清適當稀釋即可出現(xiàn)其它染色形態(tài)，證明其中尚有其他熒光形態(tài)的抗體混在其中。弱陽性均www.med126.com質型意義不明，供血員有3%～10%的陽性。

（3)斑點型（或稱小結型)：核輪廓不鮮明，核內呈斑點狀熒光。由核內Sm抗原引起的一種抗體，包括IgG、IgM或IgA三類抗體。當用原血清染色時，斑點呈大團塊狀，稀釋血清時變?yōu)榉稚⒌陌唿c狀。主要見于硬皮病及肢端動脈痙攣病（雷諾氏病)，也見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡。

（4)核仁型：僅是核仁呈現(xiàn)黃綠色熒光，血清中此類抗體較少見。用肝細胞核和培養(yǎng)細胞作抗原可以檢查出來。因血片中粒細胞及正常淋巴細胞中缺乏核仁抗原，檢查不出此抗體。此型抗體可有IgG、IgM或IgA類。最常見于系統(tǒng)性硬化癥、硬皮病、皮肌炎和sjogren’s綜合征，其他膠原病很少見。

其次，還可見核膜型、結節(jié)　樣網狀型等，沒有明確的診斷意義。ANA的相應抗原和熒光類型見表15-2。

表15-2 ANA的相應抗原和熒光類型

2．ANA的滴度與病情的關系Tablonska等的研究認為活動期紅斑狼瘡ANA的滴度在1：160或更高，國內的報告滴度在≥1：80則顯示病情的活動性，滴度高是系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷的依據之一，高滴度與病情活動性相平行。高俊達（1979)對于ANA滴度變化的臨床意義研究指出，60例系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血清中ANA滴度的變化與病情活動性、臟器損害、預后和其他化驗指標的關系如下：

（1)ANA滴度在1：80～160以上有80.5%屬臨床活動性，有89.5%～97.8%緩解期病人在1：160以下。

（2)ANA滴度變化與臨床癥狀是一致關系，但先于疾病的活動而升高，后于癥狀的緩解而下降。

（3)ANA滴度變化與狼瘡細胞、血沉、尿蛋白和血清γ球蛋白含量異常一致。

（4)ANA滴度可作強的松用量的選擇參考，ANA滴度在1：160以上者要加緊積極治療，1：40以下者可減至維持量。

ANA的免疫組織化學檢查對于診斷沒有皮膚損害的紅斑狼瘡病幫助更大，取病人的皮膚作冰凍切片，用ANa IgG熒光抗體直接法染色，可見在表皮與真皮連接處顯示熒光帶。Tuffanelli報告病人有皮膚損害，直接免疫熒光檢查ANA的陽性率為90%，在正常皮膚中紅斑狼瘡病人ANA的陽性率可達56%，而后者在其他疾病極少見，因而有較大的診斷意義。

二、雙鏈DNA抗體（Double strand DNA antibody, dsDNA)的檢測方法和應用

目前的研究指出，用免疫細胞化學檢查病人血清中的dsDNA抗體為作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷依據之一。佐佐木毅等和徐世玉等發(fā)現(xiàn)一些臨床癥狀和血清學檢查不典型的紅斑狼瘡病人，在發(fā)病早期就出現(xiàn)抗dsDNA抗體，認為這可能有助于早期診斷。

1．用馬疫錐蟲抗原檢測抗dsDNA抗體方法

（1)底物制備：用馬疫錐蟲感染小鼠2～4天后，取小鼠的外周血，按血液細胞計數(shù)法作馬疫錐蟲計數(shù)，達到4.3×10⁶～5.6×10⁶時即采尾血涂片，空氣干燥后直接使用或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2)方法和結果：血涂片加入少量水溶去紅細胞，待干。加入一滴被檢血清于其上，移濕盒中，在室溫中30～40min，用0.01mol/lpH7.4PBS洗5～10min，取出吸干，加兔抗人IgG熒光抗體，在濕盒中染色30～45min，再按上法洗片，待干，熒光顯微鏡檢查。陽性者可見錐蟲的核及動基體發(fā)出明亮綠色熒光。

2．用短膜蟲抗原檢測抗dsDNA抗體方法

（1)底物制備：用北京生物制品研究所制備的短膜蟲涂片標本作抗原。

（2)方法和結果：用上述馬疫錐蟲抗原的間接免疫熒光染色法。短膜蟲是一種血鞭毛蟲，動基體中含純凈的dsDNA可作為抗原，陽性結果可見蟲體近尾或中部有一致密熒光亮點，為動基體，近頭部有一淡綠色亮點，為細胞核。陰性結果動基體上無熒光。陽性血清自1：5稀釋，測定效價。

3．用酸洗脫鼠肝細胞抗原檢測抗dsDNA抗體方法（參考Ta的方法)

（1)底物準備：將6個月小白鼠剪斷上腔靜脈，立即用0.01mol/l pH7.4 的PBS從門靜脈灌洗至鼠肝發(fā)白，取出肝組織剪成接觸面為0.15cm×0.5cm的小塊，印片，空氣中干燥后用丙酮固定10min，再空氣干燥。浸入0.1mol/l HCl中洗脫30min，并輕輕的搖動，隨后，再用0.15mol/l PBS pH7.4洗2次，每次10min，再用0.01mol/l pH7.6的PBS洗5min，空氣干燥。即可用或在4^℃中貯存。

（2)方法和結果：用間接免疫熒光法檢測，陽性結果可見細胞核呈黃綠色熒光。用酸洗脫鼠肝細胞標本作抗原與馬疫錐蟲、短膜蟲法比較結果，和馬疫錐蟲法符合率達93%，其中馬疫錐蟲法4例陽性，為系統(tǒng)性硬皮病，而此法為陰性，說明此法較馬疫錐蟲法更特異。此法與短膜蟲法比較，符合率為95%，P>0.05，說明二法無顯著差別。其中此法陽性而短膜蟲法陰性的3例，均符合系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷，并均有腎損害。短膜蟲法陽性而此法陰性的6例均為待查病例，不能證實為系統(tǒng)紅斑狼瘡診斷，說明此法在特異性方面更佳。

三、抗核仁抗體的檢測法

用HEP-2細胞或大鼠肝細胞作抗原，作間接免疫熒光染色。結果可見細胞核核仁呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光�？购巳士贵w在硬皮病、皮肌炎、系統(tǒng)性硬化癥等中最多見。

四、抗組蛋白抗體的檢測方法

1．組蛋白的提取方法取大白鼠肝40g加入160ml0.01mol/l Ph7.4 Tris HCl緩沖液，制成勻漿后進行濃度梯度離心（27000rpm×60min)，沉淀物中加入蒸餾水90ml，再以超聲粉碎儀將細胞打碎，離心（3000rpm×15min)取上清液，再加入一定量的1mol/l 硫酸，使硫酸的最終濃度為0.2mol/L,混勻后，離心（3000rpm×15min)，取上清液，加入4～5倍體積的無水乙醇，置于-20^℃冰箱3天后，離心（3000rpm×15min)以乙醚洗滌沉淀，真空干燥，儲存于-20℃冰箱中備用。

2．酸處理的鼠腎底物　 鼠腎冰凍切片（厚度4μm)，以丙酮固定后吹干，密封，在-20^℃冰箱中儲存?zhèn)溆�。用前再�?.1mol/L鹽酸中浸泡30min，然后再置于0.01mol/l pH7.4PBS中浸泡2次。

3．組蛋白重建的鼠腎底物在上述酸處理的鼠腎底物上加入30μl乙制備好的組蛋白，稀釋濃度為25μl/ml，在室溫中濕盒內孵育30min后，以0.01mol/l p7.4PBS浸2次。

4．檢測方法用組蛋白重建的鼠腎底物，做間接免疫熒光測定。

5．結果1960年Kunkle首先在SLE中發(fā)現(xiàn)抗組蛋白抗體（Antihistone antibody ,AHA)，是診斷藥物性SLE的一項較好的指標。在活動期SLE中AHA可達90%。

五、抗著絲點抗體的檢測方法

1．HEP-2細胞涂片的制備HEP-2細胞系人喉癌上皮細胞，在完全Eagle培養(yǎng)液中，37^℃，二氧化碳孵育48～72h，使細胞生長達到一定數(shù)量，約1.2～1.5×10⁶/ml，經胰酶消化后，可以傳代或分裝到置有玻片的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)用Eagle液培養(yǎng)及上述條件孵育，48h細胞不僅貼附于玻片上并已長成單細胞層。取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20^℃或4℃中。

表15-3 各種抗核抗體及臨床意義

注：Sm（Smith)；RNP：核糖核蛋白；Sn：為小核；SSB：干燥綜合征B；SS-A：干燥綜合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000；PCNA：增殖細胞抗原；PM-1：多發(fā)性肌炎-；RANA：類風濕性關節(jié)　核抗原；dsDNA：雙鏈DNA；ssDNA：單鏈DNA。

2．染色方法用間接免疫熒光法。

3．結果著絲點抗原是緊附于染色體著絲點的DNA蛋白質，當與相應抗體結合后熒光圖型為約46個圓的熒光亮點。國際上多用HEP-2細胞，因這種細胞核大，分裂相旺盛，著絲點容易顯露，這種抗體在進行性系統(tǒng)性硬化癥（PSS)中陽性率可達31%～98%，是PSS的CREST型的標記抗體，CRESF是指具有軟組織鈣化，雷諾現(xiàn)象，食管功能低下，指端硬化，毛細血管擴張的PSS患者。

六、抗甲狀腺自身抗體（ThyroidAutoantiodies)的檢測方法

Roitt等（1956)和Witebsby等（1957)就發(fā)現(xiàn)橋本氏病人血清中有對甲狀腺提取的抗體活性，后來White（1957)首次用間接免疫熒光染色方法研究橋本氏病人血清存在對甲狀腺膠質（thyroidcolloid)的抗體獲得成功。此后，Landing等（1958)和Holbrow等（1959)以不固定的甲狀腺切片作抗原。檢查出慢性甲狀腺炎（Chronie thyroiditis)病人血清中有和細胞漿結合而呈現(xiàn)明亮染色的抗體。Blizzard等（1960),Doniach 等（1960)發(fā)現(xiàn)第二膠質抗體，血高γ球蛋白，沉淀素陰性，鞣酸細胞血凝試驗陰性，抗甲狀腺微粒體補體結合試驗陰性。Balfoour等（1961)用免疫熒光法研究一些甲狀腺病人時總結指出：甲狀腺膠質抗體有三種不同的熒光形態(tài)：一種是呈三維狀云絮狀，是一種血清沉淀素陽性產生的抗甲狀腺球蛋白抗體。另一種是膠質部分熒光呈裂紋形，膠質無明顯陽性熒光，而膠質邊緣和裂紋處呈明亮熒光，鞣酸化細胞血凝反應陽性，沉淀素反應陰性。第三種即上述的膠質呈均勻熒光形狀，證實這是一種稱第二膠質的抗體。近30多年的研究證明免疫熒光方法檢查甲狀腺自身抗體是一個特異、敏感、簡便的方法，對于臨床診斷和治療，隨訪和預后，甲狀腺某些疾病的自身免疫性質的發(fā)病機理研究等，都有一定的實用價值。我們20年大量研究結果也證明確實如此。用免疫熒光法檢查甲狀腺自身抗體已成為許多國家中，診斷甲狀腺疾病的常規(guī)檢查項目之一。

檢查這種抗體的免疫熒光方法要求取正常人的甲狀腺或手術摘出的甲狀腺組織，用冰凍節(jié)　片（3～6μm)用作甲狀腺球蛋白抗體檢查切片需要經56^℃純甲醇固定3min；用作甲狀腺微粒體抗原切片無需固定處理，因固定會破壞微粒體的抗原性。按常規(guī)間接方法進行。

關于甲狀腺抗體的研究已報告有甲狀腺球蛋白抗體，微粒體抗體，第二膠質抗體，甲狀腺刺激免疫球蛋白抗體，甲狀腺激素T₄及T₃抗體，細胞表面的促甲狀腺激素受體的抗體等。

表15-4 不同甲狀腺疾病甲狀腺自身抗體的陽性率（%)

七、平滑肌抗體（Smooth muscle antibody , SMA)的檢測

Johnson（1965)首次用免疫熒光組織化學間接法在狼瘡樣肝炎病人血清中發(fā)現(xiàn)了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham用病人自身平滑肌作抗原，證實了SMA的自身免疫性。狼瘡性肝炎或慢性活動性肝炎病人血清中SMA的陽性率可達80%以上。Donidht和Whitehouse先后報告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA為IgM，而慢性活動性肝炎病人血清中SMA在發(fā)病初期（1～4期)為IgM，而后為IgG。Anderson利用純化肌漿蛋白為抗原與肝炎病人血清中分離的IgM和IgM類SMA進行吸收試驗，證明了SMA的特異性。Holborrow Gamel和Renbe先后觀察了SMA與鼠肝細胞，腎小球及人的甲狀腺上皮細胞和血小板等組織為抗原的免疫熒光染色結果，證明這些組織的抗原性均與平滑肌肌動蛋白有著共同性抗原。

現(xiàn)在多以大白鼠胃壁和腎組織血管壁平滑肌的4～6μm冰凍切片和抗原，附bhskgw.cn/hushi/貼在干凈的蓋玻片上，電扇吹干，放入4^℃干燥劑中保存，用前可固定于95%（4^℃)酒精中1min，或不固定進行間接免疫熒光檢測。

染色結果可見胃壁平滑肌，粘膜肌層和肌絲，小血管壁平滑肌等呈現(xiàn)出明亮的黃綠色熒光。有人用熒光檢查急性期甲、乙二型肝炎暫時出現(xiàn)SMA的陽性率達80%，稀釋血清應在1：10以上的確定為陽性，一般認為，肝細胞表面存在肌動蛋白樣物質。慢性活動肝炎患者滴度在1：80以上，急性肝炎患者SMA屬IgM類，滴度1：25以上，慢性遷延性肝炎患者SMA也常陽性，滴度1：25左右。使用皮質激素者SMA轉陰或滴度降低。健康輸血員用原血清或1：5稀釋，常有9%～18%的低滴度SMA陽性，似無診斷意義，SMA與性別，年齡無關。

非肝病的SMA陽性者，主要見于傳染性單核細胞增生癥，類風濕性關節(jié)　炎，支原體感染疣，惡性腫瘤（如乳腺癌)。除傳染性單核癥滴度可達1：320外，一般常≤1:25，其血清與非肌性結構細胞不產生反應。

平滑肌抗體是抗肌球蛋白和肌纖維收縮蛋白的抗體，當肝細胞損害時，釋放抗原引起的自身免疫反應。已證實慢性活動性肝炎病人血清中平滑肌抗體是具有特異性的血清學標志，但必須是高效價（1：80)以上，因在人群中常見低效價（1：10～1：20)。臨床的研究指出，平滑肌抗體與生化指標改變程度相關，說明高效介平滑肌抗體與肝臟損害有關。Kurki等研究SMA在慢性活動性肝炎等的意義。

Middelton等報告檢查了70例腎衰病人自身抗體，腎移植后3個月平滑肌抗體IgM類陽性率占76%，而移植前14%。SLE常是SMA呈陰性結果，可作鑒別診斷參考。

八、肝細胞膜抗體（Antibodyto the hepatocyte membrane, HMA)的檢測

Lee等用Rouin氏液固定的大白鼠肝切片作抗原，作間接免疫熒光（IIF)檢查，在慢性活動性肝炎（CAH)病人血清中成功的發(fā)現(xiàn)了HMA，肝細胞膜呈現(xiàn)黃綠色熒光，12例CAH中11例HMA陽性（93%)10例原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC)全部陽性，20例膠元-血管疾病1例陽性（5%)7例非免疫肝病中1例陽性（14%)，正常人22例中僅1例陽性（5%)。

Bouin氏液固定大白鼠肝冰凍切片和IIF檢查HMA的方法很簡便，特異，對于診斷CAH和PBC，研究病因是很有價值的。

免疫熒光方法：取Wistar大白鼠復合組織（胃竇、腎皮質和髓質和肝)用恒冷箱冷凍切片機作冰凍切片，4μm厚，貼于玻片上，在空氣中干燥至少30min。在室溫中用Bouin氏液（75ml飽和苦味酸溶液，24ml甲醛，19ml冰醋酸)固定10min。切片在pH7.40.01mol/LPBS中洗3次，15min，同時攪拌，切片在空氣中干燥后立即應用，或存放在-20℃?zhèn)溆�。作間接免疫熒光染色。

表15-5 平滑肌抗體在不同疾病中的百分率

九、線粒體抗體（Mitochondrial antibody, AMA)

用人腎（新鮮手術或尸檢6h以內)采用腎皮質或大白鼠腎臟冰凍切片不需任何固定，作檢查AMA抗體的抗原底物，間接免疫熒光結果可見遠端腎小管上皮細胞漿呈現(xiàn)均勻的熒光。Walker等（1965)首先用此法在原發(fā)性膽汁性肝硬化，隱原性肝硬化和慢性活動性肝炎中發(fā)現(xiàn)AMA，以原發(fā)性膽汁性肝硬化（158例/188例)陽性率最高（84%)，由于阻塞性肝膽疾病不產生這種抗體，可作鑒別診斷的指標。

這種抗體可以是IgG，IgM及IgA，無組織和器官特異性。

Klarskin等（1972)，Walker等（1970，1972)，對于這種抗體的臨床應用進一步作了證實。AMA對疾病的發(fā)生的作用尚不明確，有人認為不起作用，有人則認為是造成肝細胞膽小管細胞進行性破壞的自身免疫過程的一個標志。而這兩種細胞受累的程度將決定性地導致原發(fā)性膽汁性肝硬化。慢性活動性肝炎和隱原性肝硬化33例中陽性率為60%，233例門脈性肝硬化和332例病毒性肝炎中未查出AMA。Vandell等對106例B型萎縮性胃炎患者檢查AMA全部陰性。我們很少見到AMA陽性的原發(fā)性膽汁性肝硬化病例。

表15-6 AMA亞類及其臨床意義

由表15-6可以看出，AMA不同亞類所對應的抗原存在的差異，其病理意義也各不相同。原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清中主要檢出抗M₂型AMA，抗原位于線粒體內膜。

十、胃壁細胞抗體（Gastricparietal cell antibodies, PCA)的檢測

Taylor等（1962)和Iruine等（1962)同一年發(fā)現(xiàn)PCA，以惡性貧血病人血清中陽性率最高（90%～100%)。慢性萎縮性胃炎國外報告陽性率20%～60%，伴有惡性貧血者可達90%。其次，甲狀腺疾病，糖尿病、腎上腺皮質機能減退及缺鐵性貧血等疾病，常伴有PCA陽性。我國惡性貧血發(fā)病率低，PCA陽性率在15%～25%之間，正常人2%～5%，60歲以上可高些（16%)。Strickland等（1973)稱PCA陽性萎縮性胃炎為A型胃炎，胃竇炎的發(fā)病率低，大部分為胃體廣泛性萎縮病變，發(fā)展后果為惡性貧血。B型患者PCA陰性，胃竇炎的發(fā)病率高，胃體部僅有局限性萎縮病變。各種疾病PCA檢出陽性率見表15-7。

表15-7 各種疾病PCA檢出陽性率

Odger等（1968)發(fā)現(xiàn)惡性貧血病人胃粘膜內含IgA細胞減少到正常的10%，IgM細胞減至50%，而IgG細胞則增加至15%，后者選擇性的出現(xiàn)在殘余的壁細胞周圍。Baur等（1968)用人胃粘膜勻漿中微粒體部分標記熒光素和9例惡性貧血病人胃粘膜切片反應，其中7例PCA陽性者的胃粘膜因有層見特異性吸附熒光的漿細胞，證實PCA是炎性浸潤的漿細胞所產生。

十一、胃泌素細胞抗體（GastrinCell antibodies, GCA)的檢測

慢性表淺性胃炎病人有33%血清中GCA陽性，慢性萎縮性胃炎病人也有32%陽性。提示慢性表淺性胃炎與慢性萎縮性胃炎可能是相同本質的病變，可能有著共同的自身免疫反應的背景和發(fā)病基礎。

GCA的檢查方法，殺死雄性小白鼠后立即取胃竇組織，固定于4%MFF液中3天（MFF液的配法：在60^℃的蒸餾水25ml中加入4g多聚甲醛，加4滴1N NaOH，再用NaOH或Na₂HPO₄調ph 至7.4后，再加入0.1mol/lPB Ph7.4 25ml)。組織脫水后，用56^℃石蠟包埋，切片3～5μm。56^℃烤干，脫蠟至水洗，取病人血清滴加在切片上，37℃45min，用常規(guī)間接免疫熒光法染色。熒光顯微鏡觀察，可見G細胞漿呈黃綠色熒光，即是GCA陽性。

十二、胰島細胞抗體（Isletcell antibady, ICAb)的檢測

Bottazzzo（1974)用人胰腺，近年有人用兔胰腺的冰凍或石蠟切片抗原，間接免疫熒光法檢測糖尿病人血清中有ICAb，發(fā)現(xiàn)約在60%～70%的新診斷的胰島素依賴型糖尿�。↖DDM)病人不論年齡大小，其ICAb均呈陽性。ICAb對胰島四種細胞均起反應，一般是暫時性的。只有約20%或更少的ICAb陽性者可持續(xù)2～5年。而單純飲食控制的非胰島素依賴型糖尿病陽性率很低，和對照組相似（約0.05%)。在IDDM病人中，有85%的糖尿病人于癥狀發(fā)作后，立即出現(xiàn)ICAb，并隨病程的持續(xù)而減少。Leudrum等（1976)報告用間接免疫熒光細胞化學發(fā)現(xiàn)ICAb在依賴胰島素的糖尿病人中陽性率為38%（319/829)。而非依賴胰島素的糖尿病人中陽性率只有1.7%（3/177)是ICAb陽性。

ICAb是針對胰島細胞細胞質成份的抗體，或許是在癥狀發(fā)生之前，緊接著細胞損害而出現(xiàn)的。提示IDDM的發(fā)病可能具有自身免疫反應的免疫病理機理。

十三、抗腎小球和肺泡基底膜抗體的檢測

免疫病理證明基底膜抗體是引起肺出血腎綜合征即Goodpasturesymdrome的主要病因。需要取病人的痛和肺穿刺活檢組織，作冰凍切片，用直接免疫熒光細胞化學方法檢測Igg ，IgM和C₃等在基底膜上沉著的情況。在腎小球和肺組織基底膜上呈線形熒光分布。在人急性腎小球腎炎中可見呈線形熒光，而膜性腎小球腎炎中，抗原抗體復合物沿腎小球基底膜呈結節(jié)　狀沉積，藉以診斷和鑒別診斷。

1．抗原切片取病人腎穿刺或肺穿刺組織，作冰凍切片，厚4～6μm，不固定。腎切片應先在顯微鏡下選取有腎小球的用作免疫熒光染色。

2．直接法免疫熒光細胞化學染色方法分別用抗人IgG、IgA、IgM和補體C₃熒光抗體染色。同時作對照試驗。

3．熒光顯微鏡檢查肺出血腎綜合征病人的肺泡基底膜，腎小球基底膜上都呈現(xiàn)明亮的線形熒光。主要是IgG類抗體，補體C₃熒光也呈線形，沿基底膜線形彌散分布。

十四、抗皮膚成分自身抗體的檢測

抗皮膚成分的自身抗體在皰疹性皮膚病中具有診斷和鑒別診斷意義，尋常性天皰瘡具有鱗狀上皮細胞間隙抗體，類天皰瘡具有基底膜帶抗體。這種自身抗體無種屬特異性。用直接免疫熒光法檢測皮膚活檢組織，間接法可用以檢測病人血清中的抗皮膚成分抗體。

1．抗原切片直接法免疫熒光細胞化學檢查，可以取病人皮膚活檢組織作冰凍切片。

間接法檢查常用大白鼠，豚鼠的食道上1/3部分作冰凍切片。也有人曾用猴、人、小白鼠和兔的食道上皮組織，人的正常皮膚，大白鼠、猴、豚鼠和兔唇和舌等作冰凍切片。認為人正常皮膚，小白鼠食道和大白鼠舌，可作為常用抗原，材料來源方便，經濟，易推廣應用。

2．免疫熒光細胞化學染色方法

（1)直接法：取病人皮膚活檢組織一部分作常規(guī)石蠟切片，HE染色，作常規(guī)病理組織學診斷，一部分作冰凍切片的直接法免疫熒光染色。熒光抗體用抗人IgG、IgA、IgM和補體C₃分別染切片。同時作對照試驗。

（2)間接法：用病人血清與食道等抗原切片反應后，分別用抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體染色陽性結果，可以進一步作滴度檢測。同時作對照試驗。

3．熒光顯微鏡檢查直接法檢測結果可見皰疹性皮膚病中各有一定的熒光形態(tài)，可見免疫球蛋白的沉積。

劉榮卿等（1987)用直接免疫熒光組織化學方法，對臨床擬診為天皰瘡或大皰性類天皰瘡病例進行檢查，活檢取病變附“正�！逼つw標本，用羊抗人IgG、IgM、IgA及C₃熒光抗體染色，結果可見天皰瘡9例中，取自“正常”組織標本均見表皮細胞間有IgG沉積，1例并有IgM、IgA，2例有C₃，7例毛囊上皮和（或)汗腺上皮細胞間有IgG、IgM、IgA、C₃沉積。用間接免疫熒光檢測8例均陽性，大皰性類天皰瘡8例中，取自“正�！逼つw標本均陽性，主要為基底膜出現(xiàn)IgG（7例)，C₃（8例)，1例為IgM，1例伴有IgA。天皰瘡及大皰性類天皰瘡均為自身免疫性疾病，皮膚及血液中分別存在抗表皮細胞表面抗體、天皰瘡抗體及抗基底膜抗體-類天皰瘡抗體，這些自身抗體結合在皮膚、粘膜的相應部位。

不同皰瘡性皮膚病的間接熒光圖形如表15-8

表15-8 皮膚抗體陽性熒光分布

（Clinical Immunology P146, 1971)

十五、唾液腺外分泌導管上皮自身抗體的檢測

在診斷Sjogren’s綜合征時檢測唾液腺外分泌導管上皮細胞抗體具有重要意義，陽性率達65%，用人或猴唾液腺組織（O型)不固定的冰凍切片，間接免疫熒光細胞化學法檢測，可見導管上皮細胞漿呈黃綠色熒光。

十六、抗橫紋肌自身抗體的檢測

抗橫紋肌自身抗體出現(xiàn)在50%以上的肌無力癥和胸腺瘤病人，正常人未發(fā)現(xiàn)。屬IgG類抗體，用間接免疫熒光法檢測此抗體，準確簡便。

1．抗原切片取人或大白鼠骨骼肌，沿肌纖維平行方向作冰凍切片，不固定。

2．間接法免疫熒光染色方法染色的方法步驟與其他自身抗體間接法相同，但在熒光抗體染色之后，要延長PBS洗滌時間，3次PBS洗滌，每次30min。封裱切片。

3．熒光顯微鏡檢查可見橫紋肌A-帶呈陽性熒光，無例外的都是胸腺腫瘤病人。單純肌無力病人主要與I帶和H帶呈現(xiàn)陽性熒光有關。某些肌無力病人血清只含與“白纖維反應抗體，另一些只含有與”紅纖維反應的抗體，呈斑點狀熒光。橫紋肌抗體和胸腺髓細胞、心肌呈一定程度的交叉反應。當血清稀釋至1：60時，可獲得更清晰的橫紋熒光圖像。

十七、腎上腺自身抗體的檢測

抗腎上腺自身抗體是對腎上腺皮質細胞漿成分的一種器官特異性抗體。主要見于慢性腎上腺皮質功能減退癥（阿狄森氏病)病人。用間接免疫熒光法檢測，陽性率約50%，其他自身免疫病陽性率2%～5%。

1．抗原切片抗原用新鮮腎上腺尸檢或手術切除標本，常用皮質醇增多癥（柯興氏病)病人手術切除的腎上腺�；蛉『锬I上腺組織，作冰凍切片。不需固定。

2．間接免疫熒光檢查方法

3．熒光顯微鏡檢查可見特異性熒光在皮髓質連接區(qū)最清晰，定位于皮質網狀帶細胞胞漿，髓質細胞不與抗體反應。

十八、類風濕因子（Rheumatoidfactor)的檢測

類風濕因子是一種抗輕度變性的IgG的自身抗體，可與人或動物的熱聚合IgG或抗原結合的IgG（即免疫復合物中的IgG)反應，而不與正常IgG反應。類風濕因子為IgM類抗體。主要見于類風濕性關節(jié)　炎產現(xiàn)人血清和組織中。

1．直接法

（1)用病人關節(jié)　滑膜或淋巴結，冰凍切片，冷丙酮固定10min。

（2)標記變性IgG或球蛋白：取人血清提取的γ球蛋白（20～25mg/ml)，按常規(guī)法標記FITC，去游離熒光素后，將標記溶液置63^℃水浴加熱10min，使γ球蛋白熱變性。加入40%2.17mol/L硫酸鈉使熱聚合體沉淀，置冰箱4h（4℃)，然后在低溫下離心30min（10000rpm)。取沉淀以預冷至4℃的蒸餾水溶解至原體積半量。用蒸餾水透析24h（4～6^℃)，再用pH7.6生理鹽水透析24h。高速離心（12000rpm)30min除去不溶性聚合物，取上清分裝，-20^℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3)直接免疫熒光染色：切片分別用以下染色試劑處理

①加標記變性γ球蛋白溶解。

②加標記抗IgM或γ球蛋白熒光抗體。

③加未標記變性γ球蛋白，作用切片后，洗滌，再加標記變性γ球蛋白。

①，②在適當稀釋的試劑染色后呈特異性熒光，大多數(shù)活動性類風濕性關節(jié)　炎，可見陽性熒光的漿細胞堆集。③陰性或熒光顯著減弱。

2．間接法 用以檢出病人血清中的類風濕因子。

抗原：用溶血素致敏的綿羊血細胞涂片。丙酮固定10min。

常規(guī)間接法染色。病人血清中有類風濕因子，與綿羊紅細胞上的溶血素（變性IgG)結合，再加入γ球蛋白熒光抗體，與類風濕因子結合。因而紅細胞呈現(xiàn)亮明的熒光，即證明類風濕因子陽性。

十九、抗中性白細胞胞漿自身抗體（Anti－eutrophilcytoplasmic autoantibody ANCA)

Davies 等（1982)首次報告在壞死性腎小球腎炎患者血清中發(fā)現(xiàn)ANCA。Hall等（1984)在4例系統(tǒng)性血管炎中也發(fā)現(xiàn)ANCA，其中3例表現(xiàn)為壞死性腎小球腎炎。Vander woude等（1985)報告血清中ANCA的滴度與診斷活動性Wegener氏肉芽腫的病情有密切關系，隨著病情緩解，ANCA的滴度逐漸降低，所以認為是診斷Wegener氏肉芽腫很敏感的指標。隨后一些研究表明檢查ANCA對診斷結節(jié)　性多動脈炎和特發(fā)性新月體腎炎均有較高的敏感性。1989年和1990年分別召開了第一和第二屆國際ANCA專題研討會，引起了國際上的廣泛重視。

ANCA抗原存在于中性白細胞的胞漿顆粒中，分子量為29kD，已證實是一種絲氨酸蛋白酶，與存在于中性白細胞嗜天青色顆粒中的絲氨酸蛋白酶-蛋白酶3（PR₃)十分相似。所以，胞漿型ANCA（C-ANCA)能與PR₃發(fā)生特異性反應。另一型稱核周型ANCA（P-ANCA)的主要抗原成分是髓過氧化物酶（MPO)，在壞死性腎小球腎炎和系統(tǒng)性血管炎患者，約90%的P-ANCA能與MPO發(fā)生特異性反應。由于有時P-ANCA同時伴有細胞核熒光，為排除假陽性，必須證明是MPO-ANCA。ANCA可以為IgG、IgM、或IgA類抗體，在不同疾病時三者的出現(xiàn)機率不同。

間接免疫熒光檢查ANCA：用肝素抗凝血分離中性白細胞，以0.01mol/l Ph7.4 PBS洗細胞3次，制涂片，吹干。無水酒精固定5min。加待測血清，37℃孵育40min，PBS沖洗。加1：10稀釋的抗人IgG-FITC熒光抗體，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次3min，磷酸緩沖淮甘油封片。熒光顯微鏡觀察。

ANCA的熒光可表現(xiàn)為C-ANCA和P-ANCA二種類型：C-ANCA熒光在胞漿中，分葉核之間有強的彌散性熒光、核無熒光。P-ANCA的熒光集中核周圍，形成環(huán)狀或不規(guī)則塊狀。

ANCA的致病機理：ANCA能使中性白細胞活化，發(fā)生呼吸爆炸，釋放胞漿中的多種水解酶，氧自由基等活性物質而導致組織損傷。由于PR₃和MPO都帶正電荷，它們能與腎小球基底膜結合，PR₃-ANCA和MPO-ANCA與之發(fā)生免疫反應導致腎小球基底膜損傷，另外，沉積在基底膜上的PR₃和MPO還能通過介導細胞免疫，參予腎組織損傷。

二十、增殖細胞核抗原抗體（Proliferativecell nuclear antigen antibody, PCNA)

培養(yǎng)細胞經促細胞分裂劑刺激，核內DNA開始合成G₀期，到最大增殖期（S期)，細胞核特異的出現(xiàn)DNA的復制，利用這一特點，制成抗原DNA聚合酶S的輔助蛋白。取培養(yǎng)細胞或人末稍血淋巴細胞經PHA，ConA刺激后涂片，間接免疫熒光檢測。結果可PHA刺激后48hDNA合成開始的S期出現(xiàn)很強的斑點型熒光，（G)期細胞無反應。

在SLE病人血清中出現(xiàn)有特異性診斷價值，出現(xiàn)率為3%～5%。

二十一、抗類風濕關節(jié)　炎相關核抗原的抗體（Antirheu－matoidarthritis associated nuclear antigen antibody, RANA)

又稱SSC抗體，RAP，可有免疫熒光間接法檢測，用人二倍體B細胞（Wil-2)或Raji細胞為抗原片，細胞滴片吹干，37℃干燥固定，因丙酮，乙醇等可使RANA失活。熒光陽性呈核內斑點型。對診斷類內濕關節(jié)　炎和伴有口眼干燥綜合征的病人有參考意義。近年發(fā)現(xiàn)其他結締組織病和正常人出率也很高，其特異性尚待進行深入研究。

二十二、抗精子抗體（Anti-spermantibody, ASA)

在正常情況下由血睪屏障將精子抗原與免疫系統(tǒng)隔離，當此屏障發(fā)生破壞，精子抗原通過副睪間隙組織的淋巴管或毛細血管而進入免疫系統(tǒng)，就會引起自身免疫反應，產生自身抗體�？咕�子抗體也可在一些女性體內產生。男性不孕癥患者血中可檢出很高陽性率的ASA。女性不孕癥也可因ASA引起精子運動障礙，導致不孕。

抗精子抗體的作用是：①ASA可使精子運動障礙不能通過子宮頸管；②精子頂體酶活性被ASA抑制，使精子不易穿透包繞卵細胞的卵丘，放射冠和透明帶；③抑制了精子與卵細胞膜的融合；④導致胚胎死亡和流產。⑤ASA的作用可使精子發(fā)生凝集，制動和結合三類。凝集抗體有精子頭對頭，尾對尾及混合型三種。

熒光抗體法和固相酶染色法常用于檢測抗精子抗體。

固相酶免疫細胞化學方法：液化新鮮精液離心棄上清，沉積的精子用PBS洗3次，加0.5ml小牛血清混勻，校正精子濃度為5×10⁷ml，涂于載玻片上，室溫自然干燥，甲醇固定10min，PBS洗2次，吹干，加被檢血清，37℃濕盒，30min，PBS洗3次，每次3min，加酶標記抗人IgG抗體，免疫熒光法則加抗人熒光抗體，37^。C濕盒30min，PBS洗3次，每次3min（或熒光顯微鏡檢查)，用DAB-H₂O₂顯色（同前述免疫酶細胞化學方法)。常規(guī)脫水、透明樹膠封固。油鏡觀察結果。陽性反應精子呈棕黃色，陰性蘭色（用伊文思藍復染)。陽性可見在精子頂體、中體，后核帽、中片、尾及尾尖等。

二十三、其他自身抗體的檢測

目前已發(fā)揮許多自身抗體，如抗膽小管抗體，見于原發(fā)性膽汁性肝硬化病人，陽性率達75%。用大白鼠肝的膽小管作抗原，間接免疫熒光染色陽性熒光定位于膽小管上皮細胞，呈均勻熒光�？股�殖細胞的自身抗體除精子外還有卵巢細胞抗體，常見不孕癥患者。

心肌抗體常見于心臟手術后綜合癥和心臟移植的受體。

結腸粘膜抗體可見于潰瘍性結腸炎患者的血清中，還有抗網織纖維抗體等。

近年對垂體細胞自身抗體研究發(fā)現(xiàn)，在多內分泌自身免疫疾病中存在抗促乳素細胞抗體，生長激素細胞抗體，ACTH細胞抗體等。

在神經系統(tǒng)中抗神經髓鞘成分的自身抗體，常見于神經脫鞘性疾病。

在一些眼科疾病中存在的自身抗體如抗晶體成分抗體，抗眼肌抗體等。

用大白鼠組織作抗原檢查自身抗體，在心肌間質，肝枯否氏細胞，平滑肌和橫紋肌模，胃及腎、肝的間質，腎小管近曲管刷狀緣等出現(xiàn)陽性熒光，這是所謂異嗜性抗體（Heterophile anti－body)，它和自身抗體易發(fā)生混淆，必須注意區(qū)分。

免疫細胞化學技術在自身免疫性疾病診斷中以免疫熒光技術應用最廣泛，但應用免疫酶技術和免疫金-銀技術也可以取得良好結果，作用用葡萄菌A蛋白的辣根過氧化物酶標記物代替熒光抗體作自身抗體檢測，所得到的結果可用光學顯微鏡檢查，適于在沒有熒光顯微鏡的實驗室應用。