1．
（1)取大白鼠的肝、腎、心、小白鼠胃，人甲狀腺，橫紋肌等單獨或制成復(fù)合冰凍切片（4～5μm，)。其中1片用56℃甲醇固定3min，另切一片不固定，分別放入濕盒中。
（2)將病人血清用0.01mol/l Ph7.2～7.4磷酸緩沖鹽水（PBS)作1：5稀釋，滴加覆蓋抗原切征，置濕盒中，37℃，30～60min。
（3)切片用PBS洗2次，每次5min。用電磁攪拌或振蕩幫助洗凈不參與反應(yīng)的血清蛋白。吹干。
（4)滴加抗人IgG或γ-球蛋白熒光抗體（用0.01%伊文氏藍(lán)稀釋)覆蓋切片，37℃中放置30min。
（5)用PBS洗2次，方法同步驟（3)，隨后，再用蒸餾水洗1min。
（6)緩沖甘油（pH9.0～9.5,PBS或碳酸鹽緩沖液1份和1份甘油混合)封片。
2．對照試驗可作空白，替代，一步法抑制或吸收等對照，以證明陽性結(jié)果的特異性。
3．熒光顯微鏡檢查陽性熒光呈明亮的黃綠色熒光，抗原組織成分呈現(xiàn)出陽性熒光時，即證明病人有對該組織成分的自身抗體，如細(xì)胞核呈明亮的黃綠色熒光即報告抗核抗體陽性。對陽性結(jié)果根據(jù)需要可進(jìn)一步作滴度檢查。
近來一些報告認(rèn)為用培養(yǎng)細(xì)胞作某些自身抗體檢查，可以取得良好的效果。
在檢查自身抗體中常�？沙霈F(xiàn)某種非特異性熒光，如粘液腺分泌物，粘液細(xì)胞，白細(xì)胞，胃粘膜表現(xiàn)的食物殘渣，心肌異嗜性抗體反應(yīng)等，以及有時用大白鼠胃組織切片出現(xiàn)的壁細(xì)胞非特異熒光等，容易引起混淆。這些問題都可通過對照試驗（包括用正常人血清)和觀察者的經(jīng)驗加以排除。
4．結(jié)果報告根據(jù)熒光顯微鏡觀察的結(jié)果一是形態(tài)特征，二是熒光的亮度。在報告時先報告陽性熒光的形態(tài)名稱加抗體如抗核抗體，再描述熒光亮度，主要靠觀察者的主觀目測，可分陰性和陽性兩種結(jié)果，陽性又可分“+”為可見較弱的熒光，“++”為明亮的熒光，“+++”為耀眼的熒光。雖然這樣的目測記錄精確度可能在不同觀察者之間有差別，但經(jīng)過訓(xùn)練和有較多的觀察經(jīng)驗后，這種方法基本上是可靠的，也便于推廣應(yīng)用。
近年使用熒光顯微分光光度計和圖像分析儀等定量檢測方法，結(jié)果比較客觀，將結(jié)果打印報告更適合于臨床診斷和科學(xué)研究，應(yīng)爭取采用這些先進(jìn)儀器和方法，改進(jìn)結(jié)果的判斷，記錄和報告。
5．免疫酶組織化學(xué)檢測自身抗體方法免疫酶組織化學(xué)間接法可以代替免疫熒光法用于自身抗體的檢測，但尚未普遍采用。其優(yōu)點是可以用普通顯微鏡觀察結(jié)果，更適合于基層實驗室使用，標(biāo)本也可長期保存。
（1)抗原（與免疫熒光法相同)。
（2)操作方法：
①抗原切片先用0.01mol/L pH7.4PBS洗1次，吹干，放入濕盒中。
②滴加1：5稀釋的待檢血清，37℃，30min。
③PBS洗2次，每次5min，吹干。
④滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記A蛋白或抗人IgG抗血清，37℃，30min。
⑤用辣根過bhskgw.cn/job/氧化物酶底物顯色（同前述免疫酶法)，室溫10min。
⑥水洗。
⑦0.1%伊文氏藍(lán)或蘇木精染色5min。
⑧水洗，常規(guī)酒精脫水，透明封片。
結(jié)果：陽性為棕色，陰性為藍(lán)色。在第3步之后可用1%H2O2作用15min消除內(nèi)源酶干擾。
6．自身抗體的聯(lián)合檢測方法在血清中存在的多種自身抗體，可用多種組織抗原組合制作成復(fù)合抗原檢測�？乖M成可包括以下組織：
（1)肝臟：①檢出抗核抗體；②抗肝細(xì)胞膜抗體；③抗膽管上皮細(xì)胞抗體；④抗核仁抗體等�？捎么笫蠡蛐�鼠肝組織。
（2)胃：①檢出胃壁細(xì)胞抗體；②平滑肌抗體；③抗核抗體。必須用小鼠胃組織。
（3)甲狀腺組織：①檢出甲狀腺球蛋白抗體；②檢出甲狀腺微粒體抗體；③檢出抗第二膠質(zhì)抗體；④檢出抗核抗體�？捎萌恕⒑铩�兔等甲狀腺組織。
（4)腎：①檢出線bhskgw.cn/zhuyuan/粒體抗體（遠(yuǎn)端腎小管)；②抗核抗體；③抗基底膜抗體。
（5)心�。嚎剐募】贵w。
（6)橫紋�。孩偌o力全并胸腺瘤A帶（暗帶)抗體；②肌無力I帶（明帶)抗體和H帶抗體；③肌無力白纖維骨骼肌抗體；④肌無力骨骼肌紅纖維抗體。
（7)人結(jié)腸；抗結(jié)腸粘膜抗體。
（8)胰腺：胰腺細(xì)胞抗體。
（9)腎上腺：腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞抗體。
（10)神經(jīng)組織：根據(jù)需要將多種抗原組合。
按間接法進(jìn)行檢測，如發(fā)現(xiàn)某種自身抗體，再作滴度測定，這是一種聯(lián)合篩選試驗，十分簡便，已作常規(guī)應(yīng)用。
7．微波增敏快速自身抗體檢測方法近年微波技術(shù)用于免疫組織化學(xué)檢測自身抗體方法，取得了良好的效果。微波是一種高頻電磁波，經(jīng)微波輻射引起離子極化，旋轉(zhuǎn)，分子間磨擦，使能量發(fā)生轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生熱能而加快了抗原抗體反應(yīng)的速度，適用于臨床快速檢驗和診斷。
（1)抗原切片（同免疫熒光法)。
（2)微波增敏快速方法
①抗原切片先用PBS洗，吹干，放入濕盒中（用有機玻璃制作，內(nèi)放少許蒸餾水)。
②滴加1：5稀釋的待檢血清，將濕盒移入微波爐內(nèi)轉(zhuǎn)盤上，調(diào)中檔微波強度輻射1min，放置5min。
③PBS洗2次，各1min。
④熒光抗體反應(yīng)1min（同步驟2)，放5min 。
⑤PBS洗2次，各1min。
⑥緩沖甘油封片。熒光顯微鏡檢測。
（3)結(jié)果：陽性為黃綠色熒光，陽性為紅色。微波爐型號不同，應(yīng)經(jīng)預(yù)實驗選定強度和時間。
