人胃螺旋菌(Gastrospirillumhominis,GH)是近來人們認識到的除幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp)外的另一類與人胃炎有關(guān)的微生物，國內(nèi)報道人群感染率明顯高于國外。由于目前國內(nèi)外對GH尚未分離培養(yǎng)成功，對Gh的研究僅限于組織學及形態(tài)學觀察，影響了對Gh本身及其致病性方面的深入認識。我們自一接受胃鏡檢查的病人中，觀察到有Gh和Hp混合感染存在，并最終純化分離到了Gh和Hp。在對Gh的傳代培養(yǎng)中，我們較系統(tǒng)地觀察了不同培養(yǎng)條件及冷凍保存對其形態(tài)等的影響�，F(xiàn)簡要報告如下。
1 材料和方法
1.1 標本來源
實驗標本來源于一位在首都醫(yī)學院附屬天壇醫(yī)院接受胃鏡檢查的50歲的男性病人，病理學檢查證實其胃粘膜是中度慢性淺表性胃炎伴中度活動性胃炎表現(xiàn)。胃鏡檢查時在胃竇部鉗取胃粘膜組織2塊，置于含10%小牛血清的布氏肉湯中，放于4°C保存4d后進行以下實驗。
1.2 胃粘膜組織尿素酶試驗
參考Christensen尿素肉湯培養(yǎng)和Morris等快速診斷法，采用2%液體尿素常規(guī)法，于4h及24h觀察結(jié)果。
1.3 細菌分離培養(yǎng)及純化
在滅菌研磨器中將胃粘膜組織研磨成勻漿，涂于含6%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板（含TMP5mg/L，萬古霉素6mg/L及多粘菌素B4mg/L)中，將平板置于含10%CO22、5%O2及85%N2的混合氣體培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)3d后涂片，在光鏡下觀察培養(yǎng)結(jié)果。在含10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中進行Gh菌單菌落純分離，并測定其尿素酶、氧化酶及過氧化氫酶活性。
1.4 不同培養(yǎng)條件下Gh生長情況
①將純化的Gh菌分別接種于含6%與10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，置混合氣體環(huán)境，37°C培養(yǎng)3d，涂片檢查細菌形態(tài)。②將純化的Gh菌接種于含6%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，局部分別滴加滅菌的布氏肉湯、新鮮脫纖維綿羊血及凍融脫纖維綿羊血，并分別加蓋一片滅菌的蓋玻片，使覆蓋部位呈厭氧狀態(tài)。放37°C培養(yǎng)3d，觀察細菌菌落生長情況及涂片觀察細菌形態(tài)。③將純化的Gh菌接種于含10%小牛血清的布氏肉湯小管中（管口加滅菌綿塞)，放混合氣體環(huán)bhskgw.cn/shiti/境，37°C培養(yǎng)3d后，直接涂片及離心沉渣涂片觀察細菌形態(tài)。④將置于保存液（含10%蔗糖和50%小牛血清)中，-70°C保存30d后的Gh菌，接種于含10%脫纖維綿羊血的布氏瓊脂平板中，37°C培養(yǎng)3d后，觀察菌落生長情況、涂片觀察細菌形態(tài)、測定其尿素酶、氧化酶和過氧化氫酶活性，并繼續(xù)傳代觀察其形態(tài)變化。
2 結(jié)果
胃粘膜組織尿素酶試驗4h及24h均為陰性。細菌初代培養(yǎng)物涂片發(fā)現(xiàn)含有Gh和Hp兩種菌。經(jīng)單菌落分離分別得到Gh和Hp菌的純培養(yǎng)，其中分離到的Gh菌株命名為Gh32。對Gh32的測定發(fā)現(xiàn)其氧化酶與過氧化氫酶均為陽性。并含有很強的尿素酶活性。Gh32在含有6%脫纖維綿羊血的布氏培養(yǎng)基上生長較差，菌落呈針尖狀。光鏡下可見細菌呈球形、腎形及短螺旋形，多數(shù)菌僅一個彎曲。在含10%脫纖維綿羊血的布氏培養(yǎng)基上生長良好，可長成1mm～2mm直徑單個菌落，光鏡下可見細菌呈多螺旋狀，螺旋數(shù)目在1～6個之間，且螺旋較密。Gh32在蓋玻片下生長不良；在滴加布氏湯和未滴加任何液體的對照部位，細菌菌落較小，呈針尖狀。在滴加新鮮血或凍融血而未被蓋玻片覆蓋處，菌落形態(tài)及光鏡下細菌形態(tài)與在含10%脫纖維綿羊血布氏瓊脂平板上生長的情況相似。Gh32在液體培養(yǎng)時生長較慢，3d后液體僅輕度混濁，涂片發(fā)現(xiàn)細菌數(shù)目較少，但菌形良好，螺旋數(shù)在3～14個不等，長度可達17μm左右。經(jīng)3，000r/min（臺式離心機上)離心3min后沉渣用少許生理鹽水懸浮涂片發(fā)現(xiàn)，多數(shù)細菌螺旋數(shù)在4～6個左右。將低溫保存Gh32初代復(fù)活時，菌落生長良好。酶活性檢查發(fā)現(xiàn)，其尿素酶、氧化酶及過氧化氫酶均為陽性。涂片發(fā)現(xiàn)幾乎所有菌體均發(fā)生了球形變。連續(xù)傳代2次后，70%左右恢復(fù)典型形態(tài)，連續(xù)傳代3次后細菌幾乎全部恢復(fù)其典型形態(tài)。
3 討論
人們對胃螺旋菌的認識已有一個較長的歷史過程。早在1881年Rappin就報道在狗胃粘膜中觀察到螺旋形細菌的存在，此后又有許多在其它哺乳動物胃粘膜中觀察到螺旋形細菌存在的報道。1906年Krienitz首先觀察到人胃粘膜中有3種不同類型的彎曲或螺旋細菌存在，但此后胃螺旋菌未能引起人們的足夠重視。隨著對幽門螺桿菌與胃炎及消化性潰瘍的關(guān)系的深入研究，人們開始重新對人胃螺旋菌進行認識。目前認為此菌可能為除Hp外的又一類與胃炎有關(guān)的細菌。自1987年來世界各地已有近百例有關(guān)Gh感染的報道，國內(nèi)楊海濤等也曾報道14例Gh感染病人。人們自豬等動物已成功地分離到了胃螺旋菌，近年來國內(nèi)外多位學者曾對Gh進行分離培養(yǎng)，但至今未見有關(guān)Gh培養(yǎng)成功的報道，對Gh的研究也僅限于對病理組織學的觀察。我們自人胃粘膜組織中成功地分離到一株Gh，為對Gh的深入研究創(chuàng)造了必要條件。
雖然目前我們只分離到一株bhskgw.cn/wszg/Gh菌，可能不能完全反映所有Gh菌所需要的培養(yǎng)條件，但我們在實驗中觀察到了Gh菌形態(tài)的易變性。在不同培養(yǎng)條件下，Gh可呈1～14個螺旋不等，甚至呈腎形或球形。Gh在培養(yǎng)條件不完全適合時，不能表現(xiàn)出其典型形態(tài)，而胃粘膜標本中往往有多種細菌存在，在選擇性培養(yǎng)基上也可能不止有一種細菌生長，對形態(tài)不典型的Gh菌，很容易被當成雜菌或Hp菌處理。我們在分離豬胃螺旋菌(Gastrospirillumsuis)時也曾發(fā)生類似情況，一度將一株豬胃螺旋菌作為幽門螺桿菌樣細菌（Helicobacter pylori like organism,hpLO)處理過，后來在半固體及液體培養(yǎng)時才觀察到其典型形態(tài)。Gh在人群中的感染率相對較低（僅1%左右)，更增加了Gh分離培養(yǎng)成功的難度。我們認為以上因素可能是造成以往分離培養(yǎng)Gh失敗的主要原因。這提示人們，在作Gh分離培養(yǎng)時，如觀察到可疑Gh菌存在時，應(yīng)增加培養(yǎng)基中含血量或進行液體培養(yǎng)，以便使Gh表現(xiàn)出其典型形態(tài)。由于Gh在固體培養(yǎng)基中菌形較短，而在液體培養(yǎng)時，雖菌形良好，但菌量較少，有關(guān)Gh的最適培養(yǎng)條件問題，仍需進一步探討。
實驗表明，Gh為微需氧菌，氧化酶和過氧化酶均為陽性，且有很高活性的尿素酶，而在胃粘膜組織直接尿素酶活性檢測時則為陰性，這可能與胃粘膜中Gh菌量較少有關(guān)。提示胃粘膜組織尿素酶陰性的依據(jù)，也不能反映Gh產(chǎn)生尿素酶活性的強弱。
實驗發(fā)現(xiàn)本病人胃粘膜中有Gh與Hp混合感染，兩菌同時感染的機會較少，目前僅有數(shù)例報道。病人經(jīng)組織學證實胃粘膜呈中度慢性淺表性胃炎伴中度活動性胃炎表現(xiàn)。Gh在胃炎發(fā)生過程中所起的作用如何，有待進一步研究。Gh的傳染和傳播途徑問題、Gh與豬、狗、貓胃螺旋菌間的關(guān)系，以及在胃內(nèi)這一特定微生態(tài)環(huán)境中Gh與Hp的關(guān)系等均有待于進一步探討。Gh的培養(yǎng)成功，使對這一系列問題的研究成為可能。
