三、核酸探針的種類
基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。
�。ㄒ�)DNA探針
DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針�，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達(dá)性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個(gè)陽性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
對于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標(biāo)蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測基因表達(dá)時(shí)雜交效率要明顯低于cDNA探針。
DNA探針（包括cDNA探針)的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
�。ǘ�)cDNA探針
cDNA（complementary DNA)是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase)的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的，這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對)。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱反向轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進(jìn)而整合人宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時(shí)復(fù)制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制，如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變，后來發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，而且哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞也含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在Trna3’-OH末端上，5’－3’方向，合成與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，稱為互補(bǔ)DNA（cDNA)，單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性作用下，將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個(gè)小引物末端，逆轉(zhuǎn)錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈，至此，完成逆轉(zhuǎn)錄全過程，合成雙鏈cDNA。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT))用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA的cRNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。
所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個(gè)有限制酶切點(diǎn)的接頭（linker)，再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉(zhuǎn)化子的文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測。
�。ㄈ�)RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV)的基因組DNA克隆時(shí)，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclear run on transcrip－tion assay)時(shí)，在體外將細(xì)胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標(biāo)記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進(jìn)行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1h內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉(zhuǎn)錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列)和反義RNA探針（與mRNA互補(bǔ))，反義RNA又稱cRNA，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測mRNA的表達(dá)水平。在這種情況下，因?yàn)樘结樅桶行蛄芯鶠閱捂�，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個(gè)數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還有一個(gè)重要用途，在研究基因表達(dá)時(shí)，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不僅進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄，有時(shí)還存在反向轉(zhuǎn)錄（即生成反義RNA)，這種現(xiàn)象往往是外源基因表達(dá)不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義RNA，參與自身表達(dá)的調(diào)控。在這些情況下，要準(zhǔn)確測定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
綜上所述，RNA探針和cRNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。
（四)寡核酸探針
前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測序時(shí)，也常應(yīng)用克隆�？寺√结樢话爿^寡核苷酸探針特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個(gè)堿基或少數(shù)堿基不同的兩序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號相當(dāng)。這既是其優(yōu)點(diǎn)，又是其缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用于檢測病原微生物時(shí)，不會因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點(diǎn)則是不能用于點(diǎn)突變的檢測。這種情況下，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短，如20nt的寡核苷酸探針在濃度為100ng/ml，靶序列為1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L時(shí)，達(dá)到最大程度的雜交只需10min，而用2kb的克隆探針在同樣條件下達(dá)到完全雜交則需16h。②寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg)，使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過細(xì)心篩選序列和/或選擇相對長的序列（＞30nt)亦可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個(gè)堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則。
�、匍L18～50nt，較長探針雜交時(shí)間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。
�、趬A基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。
③探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
�、鼙苊鈫我粔A基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè))，如-CCCCC-。
⑤一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。
按上述原則選出的探針會增加成功的機(jī)會，選定后進(jìn)行合成與標(biāo)記，并摸索合適的雜交條件。方法是制備幾張點(diǎn)有特異靶DNA和不相關(guān)DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號強(qiáng)而非特異DNA不產(chǎn)生任何雜交反應(yīng)的就是最適雜交溫度。在進(jìn)行點(diǎn)突變檢測雜交的反應(yīng)時(shí)，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號而突變型靶DNA則不產(chǎn)生雜交信號，這可以通過逐漸提高洗膜溫度來完成。
寡核苷酸探針還有一個(gè)重要用途。在用于檢測單個(gè)堿基差異時(shí)尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction)的技術(shù)。該技術(shù)只有在突變點(diǎn)位于某一限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)時(shí)才有效。例如，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個(gè)寡碼子由GAG變成GTG，從而導(dǎo)致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點(diǎn)A→T位于Del I的識別序列CT－NAG之內(nèi)，這就為設(shè)計(jì)寡核苷酸限制實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造了條件。方法是合成一個(gè)長40個(gè)堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個(gè)堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補(bǔ)。將此探針的5’末端標(biāo)記上32P。雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解鏈，然后與探針退火，產(chǎn)生雜交體。如靶DNA為βA型，則兩條鏈完全互補(bǔ)，并產(chǎn)生Dde I的酶切位點(diǎn)；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對，從而不能被Del I所識別。用Del I消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。βADNA雜交體被切開后，5’端探針序列因只有8個(gè)堿基，與雜交鏈結(jié)合不緊而解離，從而產(chǎn)生游離的5’端標(biāo)記8核苷酸單鏈。不被切開的βS雜交體尚可被另一個(gè)限制酶Hinf I消化，該酶的識別位點(diǎn)緊靠Del I 識別位點(diǎn)上游。βS雜交DNA經(jīng)Hinf I消化后，將釋出探針DNA的5’末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無Hinf I識別序列，故而不能被Hinf I消化。這樣βA和βSDNA經(jīng)此寡核苷酸探針雜交和Del I及Hinf I消化后，分別產(chǎn)生游離的8核苷酸（8nt)和3核苷酸（3nt) 片段，它們可以經(jīng)電泳分離后進(jìn)行放射自顯影而獲證實(shí)。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑒別開，如純合野生型AA結(jié)果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。
