下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：
（1)試劑
10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS)，pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉，1mmol/l EDTA, pH8.0。
5×樣品緩沖液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍(lán)。
甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L)。應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。
去離子甲酰胺。
50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。
0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。
�。�2)步驟
�、�40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混勻后 倒入盛膠槽。
�、诘饶z凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。
�、凼筊NA變性（最多20μg)：RNa 4.5μl，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl，去離子甲酰胺10.0μl。
④55℃加熱15min，冰浴冷卻。
�、菁�2μl 5×載樣緩沖液。
⑥上樣，同時(shí)加RNA標(biāo)記物。
�、�60伏電泳過夜。
⑧取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。
�、崾覝叵聦⒛z浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。
�、馐覝叵聦⒛z浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和。
�、�20×SSC洗膠1h。
�、�20×SSC中過夜，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。
�、讶〕鱿跛崂w維膜，80℃真空烘烤2h。
5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization) 組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長度以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt)能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。
探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最為常用。3H標(biāo)記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位， 缺點(diǎn)是能量低。35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好。而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。
原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進(jìn)一步完善和提高（詳見二十章 )。
6．固相夾心雜交 Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：①樣品不需要固定，對(duì)粗制樣品能做出可靠的檢測(cè)；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強(qiáng)，因?yàn)橹挥袃蓚�(gè)雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
固相夾心雜交需要兩個(gè)靠近而不互相重疊的探針，一個(gè)作固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針。樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個(gè)探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)。需注意的是兩個(gè)探針必須分別亞克隆進(jìn)入兩個(gè)分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號(hào)（如一個(gè)克隆人Puc19,另一克隆人pBR322)。
夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)和更容易對(duì)小量樣品進(jìn)行操作。Dahlen 等利用微孔板進(jìn)行夾心雜交，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上。用微孔板進(jìn)行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物標(biāo)記探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/μg)作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點(diǎn)還包括同時(shí)做多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動(dòng)化。
7．其它雜交類型
�。�1)固化探針雜交：該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合。將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物顯色并進(jìn)行測(cè)定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交，可在10～15min完成，檢測(cè)的敏感性為5×108靶序列。
�。�2)反向雜交：這個(gè)雜交類型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交反應(yīng)中，可同時(shí)檢測(cè)樣品中幾種核酸 。這種雜交方式主要用于進(jìn)行中的核酸轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和多種病原微生物的檢測(cè)。前者是在轉(zhuǎn)錄過程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。
（三)固相膜核酸雜交的幾點(diǎn)說明
1．雜交膜的選用 雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進(jìn)行檢測(cè)。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射笥標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性質(zhì)不是很清楚，推測(cè)為非共價(jià)鍵結(jié)合。經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會(huì)脫落。硝酸纖維素膜的另一特點(diǎn)是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用非同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點(diǎn)是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（＞10×SSC)，與小片段核酸（＜200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。醫(yī)學(xué)全在線bhskgw.cn
尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強(qiáng)度大、耐用，可與小至10bp的片段共價(jià)結(jié)合。在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需燒烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本。它通過疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350～500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80～100μg/cm2)強(qiáng)許多。尼龍膜的缺點(diǎn)是對(duì)蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。
2．“噪音”的排除 “噪音”（noise)是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應(yīng)液和對(duì)膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對(duì)照膜)上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應(yīng)液中充分封閉膜上的多余非特異結(jié)合位點(diǎn)。
