�。ㄋ�)液相核酸分子雜交類型
1．吸附雜交
（1)HAP吸附雜交：羥基磷灰石（HAP)層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法。在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上。通過離心使吸附有核酸雙鏈的HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。
（2)親合吸附雜交：生物素標記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到酰化親合素包被的固相支持物（如小球)上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應，加入酶顯色底物，這個系統(tǒng)可快速（2h)檢測RNA。
（3)磁珠吸附雜交：Gen – probe公司最近應用吖啶翁酯（acridinium ester)標記DNA探針，這種試劑可用更敏感的化學發(fā)光來檢測。探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體上)。溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學發(fā)光測定。
2．發(fā)光液相雜交
�。�1)能量傳遞法：Heller等設計用兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學發(fā)光基團（供體)標記，另一個探針的一端用熒光物質標記，并且這兩個探針靠得很近。兩個靠得很近的探針用不同的物質標記（標記光發(fā)射)，當探針與特異的靶雜交后，這些標記物靠得很近。一種標記物發(fā)射的光被另一種標記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調節(jié) 檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長。只有在兩個探針分子靠得近時，才能產(chǎn)生受激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。
（2)吖啶翁酯標記法：吖啶翁酯標記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標記探針分子上的吖啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點是檢測的敏感度低（約1ng的靶核酸)，僅適用于檢測擴增的靶序列，如rRNA或PCR擴增產(chǎn)物。
3．液相夾心雜交
�。�1)親合雜交：在靶核酸存在下，兩個探針與靶雜交，形成夾心結構，雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。用生物素標記吸附探針，用125I標記檢測探針，這個系統(tǒng)的敏感性可檢測出4×106靶分子。該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。
（2)采用多組合成探針和化學發(fā)光檢測：第一類探針是未標記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個堿基長，其中含有30個細菌特異序列堿基和20個堿基的單鏈長尾；第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標記檢測探針的單鏈長尾用于結合擴增多個標記探針，液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上，典型的試驗可用25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針。第一個標記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶)可實現(xiàn)未標記檢測探針的擴增。使用化學發(fā)光酶的底物比用顯色反應酶的底物更敏感。這個雜交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質�？剐缘臋z測，敏感性達到能檢測5×104雙鏈DNA分子。
4．復性速率液相分子雜交 這個方法的原理是細菌等原核生物的基因組DNA通常不包含重復順序。它們在液相中復性（雜交)時，同源DNA比異源DNA的復性速度要快。同源程度越高，復性速率和雜交率越快。利用這個特點，可以通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復性速率，進而用理論推導的數(shù)學公式來計算DNA-DNA之間的雜交（結合)度。
六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化
�。ㄒ�)探針的選擇
根據(jù)不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克隆人M13噬菌體DNA獲得)或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp)具有較大的優(yōu)越性。
在選用探針時經(jīng)常會受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時，可采用PCR方法擴增某段基因序列，并克隆人合適的質粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。
�。ǘ�)探針的標記方法
在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng)。
�。ㄈ�)探針的濃度
總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。
