藥理學(xué)實驗指導(dǎo)-第二篇 機(jī)能實驗:第十三章 神經(jīng)系統(tǒng)

第十三章  神經(jīng)系統(tǒng)

第一節(jié)  神經(jīng)干動作電位及其傳導(dǎo)速度的測定

【實驗?zāi)康?/b>】

 (1) 掌握動作電位（actionnpotential ,AP)測定原理以及傳導(dǎo)速度的測定與計算方法.

(2)觀察、識別蟾蜍坐骨神經(jīng)干雙相和單相AP。

（3)分析低溫、局麻藥和機(jī)械損傷等因素對神經(jīng)干AP及其傳導(dǎo)速度的影響機(jī)理。

【實驗原理】

神經(jīng)干受有效剌激興奮后 , 產(chǎn)生的AP以脈沖的形式按一定的速度向遠(yuǎn)處擴(kuò)布傳導(dǎo)。不同類型的神經(jīng)纖維其傳導(dǎo)興奮的速度是不相同的，直徑粗的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度快 , 直徑相同的纖維，有髓纖維比無髓纖維傳導(dǎo)快。蛙類的坐骨神經(jīng)干屬于混合性神經(jīng) , 其中包含有粗細(xì)不等的各種纖維 , 其中直徑最粗的有髓纖維 , 傳導(dǎo)速度在正常室溫下大約為 35~40m/s。測定神經(jīng)纖維興奮的傳導(dǎo)速度時, 在遠(yuǎn)離刺激點(diǎn)的不同距離處分別引導(dǎo)其AP , 兩引導(dǎo)點(diǎn)之間的距離為 d , 在兩引導(dǎo)點(diǎn)分別引導(dǎo)出的動作電位的時相差為 T�？砂凑展�式（V =d/T)計算其傳導(dǎo)速度。此外，神經(jīng)纖維在一次興奮過程中 , 其興奮性可發(fā)生周期性變化 , 包括絕對不應(yīng)期、相對不應(yīng)期、超常期和低常期。

本實驗要求學(xué)生通過離體神經(jīng)干AP的細(xì)胞外記錄法及其基本波形的判斷和測量，掌握神經(jīng)干AP及其傳導(dǎo)速度的測定方法 ,通過調(diào)整刺激條件改變離體神經(jīng)干的興奮性及其AP波形，并分析其機(jī)理。

【實驗對象】

 蟾蜍或青蛙。 

【實驗藥品與器材】

1.藥品

任氏液

2.器材

BL-420E型生物信號采集處理系統(tǒng)一套、神經(jīng)標(biāo)本盒、蛙類手術(shù)器械、濾紙、縫合線、、燒杯、滴管等。

【實驗觀察指標(biāo)】

 蟾蜍或青蛙坐骨神經(jīng)干雙相、單相AP及其傳導(dǎo)速度

【實驗方法與步驟】

(1)坐骨神經(jīng)干標(biāo)本制備

按第五章第六節(jié)兩棲類動物實驗常用手術(shù)方法分離制備坐骨神經(jīng)干，將制備好的坐骨神經(jīng)干浸泡于任氏液的燒杯中備用。

（2)連接實驗裝置

將引導(dǎo)電極、刺激輸出電極分別插入生物信號采集處理儀輸入通道2和刺激輸出通道并與神經(jīng)標(biāo)本盒相應(yīng)電極相連（實驗裝置圖13-1中S₁  S₂:刺激電極；R₁ R₂：引導(dǎo)電極)。鑷子夾住神經(jīng)干標(biāo)本兩端的線頭，將標(biāo)本近心端放在刺激電極上，遠(yuǎn)心端放在引導(dǎo)電極上。

 圖13-1 實驗裝置示意圖

（3)觀察坐骨神經(jīng)干雙相動作電位

雙擊BL-420E圖標(biāo)進(jìn)入生物信號采集處理系統(tǒng)軟件界面，在實驗項目欄中調(diào)出動作電位檢測模塊，點(diǎn)擊“刺激”按鈕，系統(tǒng)開始采樣，適當(dāng)調(diào)整各通道放大倍數(shù)及X、Y軸壓縮比，即可產(chǎn)生雙向動作電位。如改刺激參數(shù)為刺激個數(shù)為2，并適當(dāng)增加時間間隔至1秒，即可觀察到神經(jīng)干的2個雙向AP。

（4)測定神經(jīng)興奮傳導(dǎo)速度

先用直尺測量兩對引導(dǎo)電極之間的距離（距離d=R₁ 與R₂之間的距離)，啟動“刺激”鍵，觀察神經(jīng)干AP波形變化，點(diǎn)擊測量圖標(biāo)，即可手動測量兩個AP之間的時間（時間T=兩個AP起點(diǎn)的間隔時間)。按公式V= d/T計算AP傳導(dǎo)速度。

①測量正常AP傳導(dǎo)速度。

②將標(biāo)本置于4℃任氏液中浸泡5分鐘后，觀察AP變化,測定其傳導(dǎo)速度。

③調(diào)換標(biāo)本方向，觀察AP有無變化。

④保持刺激電極與引導(dǎo)電極間距離不變，改變兩引導(dǎo)電極（R₁與 R₂)間距離觀察雙相AP變化。

⑤對調(diào)兩引導(dǎo)電極的位置，觀察雙相AP變化。

⑥在兩引導(dǎo)電極之間滴一滴普魯卡因，觀察AP波形變化。

⑦用鑷子將兩引導(dǎo)電極之間的神經(jīng)夾傷，觀察AP波形的改變。

⑧實驗結(jié)束后，選取“文件”下的打印，打印實驗結(jié)果。

（5)測定神經(jīng)興奮不應(yīng)期

另取一根制備好的坐骨神經(jīng)干標(biāo)本置于神經(jīng)標(biāo)本盒電極上，在“實驗項目”下拉菜單中點(diǎn)擊“神經(jīng)干不應(yīng)期”項，系統(tǒng)自動彈出刺激方式對話框，選擇“程控”，設(shè)兩次刺激初始間隔為30ms,依次遞減間隔步長為2ms。當(dāng)兩次刺激間隔時間越來越短時，第二個AP波形開始減小，表明第二個刺激落入第一次興奮后的相對不應(yīng)期。當(dāng)兩次刺激間隔時間縮短為1～2ms時，第二個AP完全消失，說明第二個刺激落入到第一次興奮后的絕對不應(yīng)期。

【注意事項】

（1)實驗前和實驗后，必須用任氏液棉球擦拭干凈神經(jīng)標(biāo)本盒全部電極，使電極保持良好的導(dǎo)電性能。

（2)神經(jīng)干應(yīng)盡可能分離得長一些，全長須在8cm以上。

（3)神經(jīng)干分離過程中勿損傷神經(jīng)組織，以免影響實驗效果。

（4)神經(jīng)標(biāo)本盒保持接地，實驗時應(yīng)蓋上神經(jīng)標(biāo)本盒的盒蓋，以防干擾與神經(jīng)干燥。

【思考題】

（1)本實驗采用的方法是細(xì)胞外記錄AP，此外還有何種方法記錄AP？

（2)神經(jīng)干AP與單一神經(jīng)纖維的AP有何區(qū)別?

（3)為什么一般情況下記錄到的雙相動作電位的波形是不對稱的?

（4)神經(jīng)干雙相和單相AP產(chǎn)生、傳導(dǎo)和引導(dǎo)原理如何?

（5)絕對不應(yīng)期內(nèi)，為什么神經(jīng)對任何強(qiáng)度的刺激都不再發(fā)生反應(yīng)？

（6)低溫、標(biāo)本倒向、改變兩引導(dǎo)電極間距離、對調(diào)兩引導(dǎo)電極的位置、改變刺激電極和引導(dǎo)電極間的距離、用藥物阻斷或機(jī)械損傷等分別對神經(jīng)干AP的波形、傳導(dǎo)速度有何影響？為什么？

   （金海燕、韓偉)

第二節(jié) 主動脈神經(jīng)放電與動脈血壓的調(diào)節(jié)

【實驗?zāi)康?/b>】

（1)學(xué)習(xí)哺乳類動物在體神經(jīng)干動作電位的引導(dǎo)和血壓直接測量方法，觀察機(jī)械刺激、電刺激、藥物及神經(jīng)體液因素對家兔血壓的影響。

（2)分析動脈血壓與主動脈神經(jīng)放電的電壓、頻率、聲音變化的相互關(guān)系。

【基本原理】

    正常生理情況下，人和哺乳類動物的動脈血壓相對穩(wěn)定性是通過神經(jīng)和體液因素調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，其中主動脈弓一頸動脈竇壓力感受性反射（減壓反射)尤為重要。此反射既可使升高的血壓下降，又可使降低的血壓升高，起著血壓波動緩沖的作用。主動脈神經(jīng)是主動脈弓壓力感受器的傳入纖維，當(dāng)動脈血壓升高或降低時 , 主動脈弓壓力感受器經(jīng)主動脈神經(jīng)傳入沖動也隨之增強(qiáng)或減弱, 使壓力感受性反射相應(yīng)增強(qiáng)或減弱 ,使血壓相應(yīng)降低或升高， 以保持動脈血壓相對穩(wěn)定。多數(shù)哺乳動物的主動脈神經(jīng)在頸部混入迷走神經(jīng)，而家兔的主動脈神經(jīng)在解剖上獨(dú)成一支，又稱為減壓神經(jīng)，易于分離，可用于觀察動脈血壓變化對主動脈神經(jīng)沖動強(qiáng)弱的影響。

    本實驗通過測定動脈血壓波動和檢測主動脈神經(jīng)放電強(qiáng)度并分析其變化的相互關(guān)系，以加深對減壓反射生理意義的理解。

【實驗動物】 

家兔，體重2-3kg，性別不拘。

【實驗藥品與器材】

1.藥品

25％氨基甲酸乙酯（或3%戊巴比妥鈉)，1：10000去甲腎上腺素溶液、1：10000乙酰膽堿溶液、利血平注射液、生理鹽水、肝素生理鹽水，液體石蠟(加溫38—40℃)。

2.器材

生物信號采集與處理系統(tǒng)一套、血壓換能器1個、手術(shù)器械一套、動脈插管1個、雙極銀絲引導(dǎo)電極1根、鐵支柱2個、試管夾、雙凹夾2個、1支（或等藥)、50ml注射器1個、1ml注射器2個、10ml注射器1個、等。

【實驗觀察指標(biāo)】

（1)兔動脈血壓。

（2)兔減壓神經(jīng)放電頻率、幅度。

（3)監(jiān)聽放電聲音。

【實驗方法與步驟】

（1)麻醉與固定  

用20％氨基甲酸乙酯（5ml／kg)耳緣靜脈緩慢注射，待動物麻醉后，將其仰臥位固定于兔手術(shù)臺上。

（2)分離減壓神經(jīng)、血管、氣管

 頸前部備皮后，頸部正中切開4-6 cm，用止血鉗分離皮下組織，分開胸舌骨肌，暴露氣管，在氣管外側(cè)找到與氣管平行的血管神經(jīng)鞘，鞘內(nèi)有頸總動脈、迷走神經(jīng)(最粗)、交感神經(jīng)(次之)和減壓神經(jīng)(最細(xì))。用玻璃分針將減壓神經(jīng)從血管神經(jīng)束中分離出來1.5 -2cm，動作要輕柔細(xì)致，其下方穿一根浸濕的細(xì)絲線備用。用同樣方法依次分離交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)、氣管、頸總動脈，分別穿線備用。

（3)行氣管插管、左頸總動脈插管術(shù)

氣管插管：在甲狀軟骨下2—3cm，做倒“T”形切口，向下插入氣管插管，結(jié)扎固定好插管，便于保證呼吸通暢。

動脈插管：結(jié)扎左頸總動脈遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉近心端阻斷血流，動脈夾與結(jié)扎線之間應(yīng)相距3cm左右。在靠近遠(yuǎn)心端結(jié)扎部位用眼科剪作1/2斜切口，向心臟方向插入灌滿肝素生理鹽水并與血壓傳感器相連接的動脈插管，扎緊插管尖端并固定于其側(cè)管，以防插管滑出，松開動脈夾觀察插管內(nèi)是否有血液博出。

（4)安置引導(dǎo)電極

將引導(dǎo)電極固定于支架上，調(diào)節(jié)好引導(dǎo)電極于合適的位置，用玻璃分針輕輕挑起減壓神經(jīng)放置于引導(dǎo)電極上，使電極與神經(jīng)良好接觸，電極不能與周圍組織接觸，但又不過度牽拉神經(jīng)。

（5)實驗裝置與儀器準(zhǔn)備

將血壓傳感器、生物電引導(dǎo)電極與生物信息采集處理系統(tǒng)相連接。雙擊生物信號采集處理系統(tǒng)圖標(biāo)。在“實驗項目”欄中調(diào)出“減壓神經(jīng)放電”項，點(diǎn)擊開始圖標(biāo)，適當(dāng)調(diào)整各通道放大倍數(shù)，直至觀察到理想的波形曲線。①動脈血壓：辨認(rèn)血壓波形曲線的一級波和二級波，有時可見三級波。②減壓神經(jīng)放電波形與聲音：放電頻率和電壓呈遞減的三角波為減壓神經(jīng)放電波形的主要特點(diǎn)，其聲音類似于火車行駛的轟隆聲，如聲音太小不清楚，可調(diào)節(jié)音箱音量旋鈕，放大音量，或加大信號通道的放大倍數(shù)。

（6)實驗步驟

（1)動脈夾夾閉右頸總動脈遠(yuǎn)心端5—10秒，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度、聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（2)從耳緣靜脈注射1：10000去甲腎上腺素0．2 -0．3m1，觀察減壓神經(jīng)放電的頻率、幅度、聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（3)從兔耳緣靜脈注射1：10000乙先膽堿0.3 m1，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（4)電刺激減壓神經(jīng)

剪斷對側(cè)減壓神經(jīng)，分別刺激中樞端與外周端（刺激電壓：1—2v，刺激時間：5-10s)，觀察減壓神經(jīng)放電頻率、幅度聲音與血壓變化相互關(guān)系。

（5)電刺激迷走神經(jīng)

剪斷迷走神經(jīng)，分別刺激中樞端與外周端（刺激電壓：1—2v，刺激時間：5-10s)，觀察血壓的變化。

【注意事項】 

（1)減壓神經(jīng)纖細(xì)，分離時，動作要輕柔細(xì)致，切勿盲目牽拉，以免損傷。

（2)引導(dǎo)電極與減壓神經(jīng)干須緊密接觸并懸空，避免觸碰周圍組織，影響電信號的引導(dǎo)。

（3)實驗過程中，可滴少量生理鹽水防止減壓神經(jīng)干燥。

（4)引導(dǎo)電極兩極間距為2mm左右，以防短路。

（5)實驗步驟1～5，均必須待減壓神經(jīng)放電及血壓恢復(fù)正常后，方可進(jìn)行下一步驟。

【思考題】

（1)觀察心縮期與心舒期血壓和減壓神經(jīng)放電的變化，分析減壓神經(jīng)放電與血壓的相互關(guān)系。

（2)試述夾閉頸總動脈后，減壓神經(jīng)放電、血壓發(fā)生變化的機(jī)理。

（3)試述注射去甲腎上腺素和乙酰膽堿后，減壓神經(jīng)放電、血壓發(fā)生變化的機(jī)理。

（4)根據(jù)實驗結(jié)果分析減壓神經(jīng)是傳入神經(jīng)還是傳出神經(jīng)，闡述減壓反射調(diào)節(jié)的生理意義。

（5)本實驗采用的動脈血壓測量法是屬直接測量法，還是屬間接測量法？

 （金海燕、韓偉)

第三節(jié)  香煙的毒性作用

【實驗?zāi)康?/b>】

觀察煙對小鼠的毒性作用，以明確吸煙對人體的危害。

【實驗原理】

煙堿（nicotine，尼古丁)是煙葉（tobacco)的重要成分，具有N膽堿能受體激動作用，可興奮自主神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)肌接頭的N膽堿受體，其對神經(jīng)節(jié)N受體和神經(jīng)肌接頭N受體的作用呈雙相性，即小劑量激動N受體，大劑量阻斷N受體。

本實驗用煙堿提取器制備煙堿溶液，給實驗動物腹腔注射煙堿溶液，觀察煙堿吸收過程中N受體由激動至阻斷時的動物興奮性的變化。

【實驗對象】

小鼠。

【實驗藥品與器材】

水煙斗、火柴、1.0ml注射器、10.0m1量筒，香煙、生理鹽水。

【實驗觀察指標(biāo)】

小鼠的肌肉活動、呼吸、末梢循環(huán)情況，最后是否死亡。

【實驗方法與步驟】

（1)量筒量取生理鹽水4.0m1置于煙斗內(nèi)，搖勻后，先用注射器抽取1.0ml液體(對照組用)，然后，將香煙插于水煙斗上并點(diǎn)燃，于煙斗嘴處用洗耳球抽吸促使繼續(xù)燃燒，使煙霧經(jīng)煙斗內(nèi)溶液過濾，此時，煙霧內(nèi)部分水溶性毒物如尼古丁(煙堿)等，即溶于水中。

（2)取小鼠2只，觀察正常情況后，甲鼠腹腔注射煙過濾液0.5m1，乙鼠則腹腔注射吸煙前煙斗內(nèi)溶液0.5m1做對照，逐步觀察并比較兩小鼠的表現(xiàn)(肌肉活動、呼吸、末梢循環(huán))。

實驗結(jié)果填入表13-1中：

表13-1  香煙濾液對小鼠的毒性作用

【實驗注意事項】

（1)在煙斗嘴處用洗耳球抽吸促使香煙繼續(xù)燃燒的過程要緩慢，使尼古丁充分溶解于生理鹽水中。

（2)腹腔注射煙過濾液0.5m1后如果毒性反應(yīng)不明顯，可酌情增加劑量。

【思考題】

含有尼古丁的煙過濾液為什么可使小鼠出現(xiàn)一系列中毒表現(xiàn)?

（陳臨溪  廖端芳)

第四節(jié)  有機(jī)磷酸酯類的中毒與解救

【實驗?zāi)康摹?/b>

（1)觀察實驗動物在有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥­——敵百蟲中毒時的中毒癥狀，以及中毒時血液膽堿酯酶活力的抑制情況。

（2)根據(jù)阿托品、解磷定對有機(jī)磷酸酯類中毒的解救效果及對血液膽堿酯酶活力的影響，分析兩藥的解毒原理。

（3)熟悉血液膽堿酯酶活性的檢查方法。

【實驗原理】

有機(jī)磷酸酯類通過多種途徑吸收后，與膽堿酯酶呈難逆性結(jié)合，抑制膽堿酯酶活性，使其喪失水解乙酰膽堿的能力，造成膽堿能神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿大量堆積，產(chǎn)生一系列急性擬膽堿中毒癥狀。

阿托品為選擇性的M膽堿受體阻斷劑，很大劑量時還可阻斷N_l受體，可與乙酰膽堿競爭結(jié)合M、N_l受體，阻斷乙酰膽堿對這些受體的激動作用， 因而可以有效地解除有機(jī)磷酸酯類中毒的M樣癥狀和N_l樣癥狀，是解救有機(jī)磷酸酯類中毒的對癥治療藥物。

碘解磷定 (pyraloxime iodide，PAM) 是有機(jī)磷酸酯類中毒的特效解救藥，因其可使膽堿酯酶復(fù)活，恢復(fù)膽堿酯酶水解乙酷膽堿的能力，因而能徹底解除有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥急性中毒的癥狀和體征，但其對循環(huán)和呼吸的解救作用起效較慢，臨床上常需配合阿托品類藥物一起使用。是解救有機(jī)磷酸酯類中毒的對因治療藥物。

本實驗給實驗動物家兔腹腔注射有機(jī)磷酸酯類敵百蟲溶液后，觀察家兔出現(xiàn)敵百蟲中毒時的中毒癥狀和血液膽堿酯酶活力的抑制情況；觀察比較阿托品、碘解磷定對有機(jī)磷酸酯類中毒的解救效果及對血液膽堿酯酶活力的影響，并分析兩藥的解毒原理。

【實驗對象】

家兔2只，雌雄不拘。

【實驗藥品與器材】

3％精制敵百蟲溶液、0.2％硫酸阿托品溶液、2.5％碘解磷定溶液、二甲苯。家兔固定箱、注射器、預(yù)先加草酸鉀的試管、試管架、刀片、干棉球、瞳孔尺與木夾。

【實驗觀察指標(biāo)】

瞳孔大小、唾液分泌情況、呼吸、大小便、肌張力、肌震顫及最后結(jié)果。

【實驗方法與步驟】

  （1)編號，稱重，觀察一般情況

取家兔2只，編號、稱重后，觀察動物的活動情況和呼吸狀況(頻率、幅度、是否困難等)，以及瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力、有無肌震顫等，分別加以記錄并填入下表。

   （2) 測定血液膽堿酯酶活力

將2只家兔分別固定于箱內(nèi)，以蘸有二甲苯的棉球涂擦耳殼，使血管擴(kuò)張。當(dāng)充血明顯后，用刀片切割耳靜脈(切口不宜過大、過深)，讓血液自然流出，滴入預(yù)先裝有少量草酸鉀結(jié)晶的試管中，立即搖勻，用于測定血液膽堿酯酶活力，如取血后切口流血不止，可用干棉球按壓止血。

   （3)腹腔注射敵百蟲，觀察中毒癥狀，并取血再次測定血液膽堿酯酶活力

將2只家兔，分別腹腔注射3％敵百蟲3 ml/ kg，密切觀察給藥后家兔各項生理指標(biāo)的變化，記錄并填入下表，待中毒癥狀明顯后，再按上述方法取血，供測定血液膽堿酯酶活力之用。

   （4) 給予特殊解救藥，觀察、比較解救效果

當(dāng)家兔中毒癥狀明顯后，立即給甲兔由耳緣靜脈注射0.2％硫酸阿托品溶液1.0 ml／kg，給乙兔由耳緣靜脈注射2.5％碘解磷定2.0 ml／kg，然后每隔5 min，再檢查各項生理指標(biāo)1次，觀察2只家兔的情況有無好轉(zhuǎn)，特別注意甲兔和乙兔的區(qū)別。待有關(guān)中毒癥狀明顯消減以后，再由2只家兔的靜脈取血，測定血液膽堿酯酶活力。

實驗結(jié)果按表13-2的內(nèi)容逐項填寫。

表13-2 有機(jī)磷酸酯類中毒與解救的實驗結(jié)果

【實驗注意事項】

(1) 敵百蟲屬于劇毒類殺蟲劑，且可從皮膚吸收，如與手等接觸后，應(yīng)立即用水清洗。

(2) 給家兔實施腹腔注射敵百蟲后，15min時仍未出現(xiàn)中毒癥狀，可再追加1／3劑量的敵百蟲溶液。

(3) 預(yù)先暴露好耳緣靜脈，抽好阿托品與碘解磷定，以便急救。

（4)阿托品給藥宜快，碘解磷定給藥宜慢。

（5)本實驗為分析阿托品和碘解磷定的作用機(jī)制而設(shè)。應(yīng)切記，在臨床實際中，須將阿托品與解磷定配合使用，才能獲得最好的解毒效果。

【思考題】

1. 試驗中阿托品和碘解磷定給藥時間過早則動物中毒癥狀觀察不完全，而給藥過晚則易導(dǎo)致動物因搶救不及時而死亡，步驟（4)中該如何把握上述解藥的給藥時間？

2. 試根據(jù)本次實驗結(jié)果，分析有機(jī)磷酸酯類的中毒機(jī)制及阿托品和解磷定的解毒原理。

【附】比色法測定血液膽堿酯酶活力

【實驗原理】

血液的膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解而產(chǎn)生乙酸與膽堿。在一定的溫度、pH和時間等條件下，水解的乙酰膽堿量與膽堿酯酶的活性成正比。因此在一定量的血液中加入一定量的乙酰膽堿，使之反應(yīng)一段時間后，測定血液中剩余的乙酰膽堿量，便可計算出已水解的乙酰膽堿量，進(jìn)而測出膽堿酯酶的活力。

醫(yī)學(xué)全.在線bhskgw.cn剩余乙酰膽堿的測定是利用乙酰膽堿與羥胺作用生成羥肟酸，后者在酸性條件下進(jìn)一步與三價鐵離子作用，生成紅棕色的羥肟酸鐵絡(luò)合物，因此顏色的深淺即可反映乙酰膽堿含量的多少。

【實驗藥品與器材】

吸管、試管、試管架、恒溫水浴、光電比色計。

0.133mol／L磷酸氫二鈉溶液：稱取Na₂HPO₄·12H₂O 23.87 g，用蒸餾水溶解并稀釋至500m1。

0.133mol／L 磷酸二氫鉀溶液：稱取KH₂P0₄  9.08 g，用蒸餾水溶解并稀釋至500 ml。

pH7.2磷酸鹽緩沖液：取0.133mol／L磷酸氫二鈉溶液72 ml，與0.133mol／L磷酸二氫鉀溶液28 ml混和即成100 ml pH7.2磷酸鹽緩沖液。

0.001mol／L pH4.5醋酸鹽緩沖液：先用每升含冰醋酸5.78 m1的水溶液28 ml和每升含醋酸鈉(不含結(jié)晶水)8.20 g的水溶液22ml混和，配成0.1 mol／L pH4.5的醋酸鹽緩沖液，再用蒸餾水稀釋100倍。

0.07mol/L乙酰膽堿底物貯存液：快速稱取氯化乙酰膽堿0.127 g(或溴化乙酰膽堿0.158 g)，溶于0.001 mol／L PH4.5醋酸鹽緩沖液10 m1中。4℃下保存（可保存4周)。

0.007 mol／L乙酰膽堿底物應(yīng)用液：試驗前取0.07 mol／L乙酰膽堿底物貯存液，用pH7.2磷酸鹽緩沖液稀釋10倍。

堿性羥胺溶液：臨用前20分鐘內(nèi)取等量的14％氫氧化鈉溶液和14％鹽酸羥胺溶液，混和即成。

33.3％(V／V)鹽酸溶液：取比重為1.18的鹽酸50 ml，加蒸餾水100ml。

10％三氯化鐵溶液：稱取FeCl₃·6H₂O 10 g，用0.1 mol／L 鹽酸溶解，使成100 ml。

【實驗方法與步驟】

按表13-3進(jìn)行操作，每加一種試劑后均須充分搖勻后再加入下一種試劑，水浴的溫度和時間須按要求嚴(yán)格控制。

表13-3  比色測定法的實驗操作步驟

濾紙過濾，15 min內(nèi)用721型分光光度計比色，測定在525 nm處的吸光度，以空白管校正光密度到0點(diǎn)，讀取各管吸光度進(jìn)行計算：

標(biāo)準(zhǔn)管吸光度

注：以1 m1血液在規(guī)定條件下能分解l μmo1乙酰膽堿為1個膽堿酯酶活力單位。

(雷小勇 廖端芳)

第五節(jié) 藥物的鎮(zhèn)痛作用

【實驗?zāi)康摹?/b>

1.了解評價藥物鎮(zhèn)痛作用的常見藥理學(xué)實驗方法

2.比較臨床常用的兩類不同的鎮(zhèn)痛藥鎮(zhèn)痛作用有何不同。

【實驗原理】

在動物的皮膚、內(nèi)臟等多處部位分布有初級傳入神經(jīng)元，可以感受溫度、酸堿，機(jī)械及化學(xué)物質(zhì)等在內(nèi)的多種有害或傷害性刺激，產(chǎn)生的生物信號通過傳入神經(jīng)纖維經(jīng)脊髓最后上傳入大腦皮層感覺中樞，經(jīng)過信號的調(diào)制，最終形成痛覺。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在一些內(nèi)源性阿片肽，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)激素，通過選擇性作用于其特異性受體——阿片受體，對痛覺的產(chǎn)生或傳導(dǎo)起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前已知的阿片受體主要分三型——μ、δ、κ。噴他佐辛（又名鎮(zhèn)痛新)為阿片受體的部分激動劑，通過激動κ受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，但作用僅為嗎啡的1/3，同時由于有輕度的μ受體拮抗作用，成癮性小，藥政管理上屬非麻醉品，臨床上主要用于各種慢性劇痛。

阿司匹林為非甾體類抗炎藥的典型代表藥，主要通過抑制外周前列腺素類物質(zhì)的合成進(jìn)而使局部痛覺感受器敏感性降低，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。該類藥物僅有中等強(qiáng)度鎮(zhèn)痛作用，但無成癮性，臨床上主要各類慢性鈍痛，而對急性銳痛、平滑肌絞痛效果較差。

【實驗對象】

健康雌性小鼠10～12只。

【實驗藥品與器材】

0.1％鹽酸噴他佐辛溶液，4％阿司匹林溶液，0.6%醋酸溶液，生理鹽水

鼠籠，熱板儀，天平，1ml注射器

【實驗觀察指標(biāo)】  

小鼠出現(xiàn)痛反應(yīng)——熱板法：扭體反應(yīng)或抬后足、舔后足并回頭；扭體法：表現(xiàn)為腹部收縮，軀體扭曲，臀部抬高，后肢伸展，蠕行——所需時間。

【實驗方法與步驟】

實驗一（熱板法)

1.  動物的選擇：將熱板儀溫度調(diào)到55℃0.5℃，把小鼠放在熱板儀上，測定各小鼠的正常痛反應(yīng)（包括抬后足或舔后足并回頭)出現(xiàn)所需時間，重復(fù)一次，每次間隔5分鐘，取均數(shù)，平均時間超過30秒的小鼠棄去不用，如是選出3只，編號、稱重后待用。

2.  將3只小鼠分為3組，其中甲鼠給予腹腔注射0.1％鹽酸噴他佐辛0.1ml/10g (0.15mg/10g),同時給乙鼠腹腔注射4％阿司匹林溶液 0.15ml/10g(6mg/10g),給丙鼠腹腔注射等量生理鹽水0.15ml/10g。

3.  給藥后15、30、45、60分鐘按步驟1觀測并記錄小鼠出現(xiàn)痛反應(yīng)所需時間，如小鼠在熱板儀上超過60秒還不出現(xiàn)痛反應(yīng)，則痛反應(yīng)時間按60秒計算。

4.  按下列公式計算小鼠痛閾提高的百分率：

   用藥后痛反應(yīng)出現(xiàn)時間－用藥前痛反應(yīng)出現(xiàn)的時間

   痛閾提高百分率＝  ╳ 100%

用藥前痛反應(yīng)出現(xiàn)的時間

實驗二（扭體法)

1.  取小鼠9只，稱重、編號后待用。

2. 將9只小鼠分為3組，其中甲組小鼠給予腹腔注射0.1％鹽酸噴他佐辛0.1ml/10g (0.15mg/10g),同時給乙組小鼠腹腔注射4％阿司匹林溶液 0.15ml/10g(6mg/10g)，給丙組小鼠腹腔注射等量生理鹽水0.15ml/10g，注射30分鐘后，每只小鼠分別腹腔注射0.6%醋酸溶液：0.2ml/只，觀察15分鐘內(nèi)各組中發(fā)生疼痛陽性反應(yīng)——扭體反應(yīng)（腹部收縮，軀體扭曲，臀部抬高，后肢伸展，蠕行)的小鼠數(shù)目，集中全實驗室的實驗結(jié)果，按下列格式計算藥物鎮(zhèn)痛作用的百分率。

用藥組無扭體反應(yīng)鼠數(shù)－生理鹽水組無扭體反應(yīng)鼠數(shù)

 藥物鎮(zhèn)痛作用的百分率＝╳ 100%

生理鹽水組無扭體反應(yīng)鼠數(shù)

【實驗注意事項】

1.   實驗中應(yīng)選用雌性小鼠，因雄性小鼠受熱后陰囊會下墜而接觸電熱板，而陰囊皮膚對熱刺激敏感，導(dǎo)致實驗測定的痛反應(yīng)時間不準(zhǔn)。

2.   測定小鼠疼痛反應(yīng)時一旦小鼠出現(xiàn)典型疼痛反應(yīng)即立即移開電熱板，即使60秒鐘無疼痛反應(yīng)也應(yīng)立即移開，以免導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重燙傷。

3.   實驗室室溫以15～20℃為宜，過高小鼠過于敏感，且易于導(dǎo)致小鼠蹦跳，而溫度過低則小鼠反應(yīng)遲鈍，影響實驗結(jié)果。

4.   實驗過程中小鼠在熱板上15秒內(nèi)出現(xiàn)不安：舉前足、舔前足、踢后肢、跳躍等均不作為痛反應(yīng)指標(biāo)，只有出現(xiàn)抬后足或舔后足才是疼痛指標(biāo)。

5.   0.6%醋酸溶液應(yīng)新鮮配制。

【思考題】

噴他佐辛和阿司匹林鎮(zhèn)痛作用有何不同？

覃麗  謝志忠

第六節(jié)  藥物對抗中樞興奮藥驚厥的作用

【實驗?zāi)康?/b>】

① 學(xué)習(xí)抗驚厥實驗方法，了解實驗性癲癇動物模型的制備方法；

② 觀察抗癲癇藥對戊四氮驚厥的作用。

【實驗原理】

 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)常用電刺激、聲刺激或化學(xué)法等方法建立實驗性動物驚厥模型，用來篩選抗癲癇藥物�；瘜W(xué)法指使用大劑量的某些化學(xué)藥品引起實驗動物驚厥發(fā)作，以觀察事先給予受試藥物對癲癇的防止效果，是一種操作簡便、不需要特殊儀器裝置的抗驚厥實驗方法。常用的化學(xué)藥品有戊四氮、氨基脲、尼可剎米等。戊四氮為主要興奮延髓的中樞神經(jīng)興奮藥，過量可興奮大腦和脊髓，表現(xiàn)為強(qiáng)烈的陣攣性驚厥，繼續(xù)發(fā)展可引起強(qiáng)直性驚厥，其致驚的主要作用部位在腦干和大腦，發(fā)生機(jī)理可能是增加中樞神經(jīng)細(xì)胞對K⁺的通透性，提高細(xì)胞外K⁺濃度，使細(xì)胞膜部分去極化而提高其興奮性，增強(qiáng)了興奮性突觸的易化過程，也可能與戊四氮阻止腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA)的自發(fā)釋放有關(guān)。戊四氮在閾劑量時，引起頭部及前肢抽搐，但不影響翻正反射，此為戊四氮發(fā)作閾值實驗（Metrazol seizure threshold test, MST)，屬癲癇小發(fā)作模型；大劑量戊四氮則可引起全身性陣攣性驚厥，繼而發(fā)展成強(qiáng)直性驚厥，甚至可引起死亡，此稱為戊四氮最大發(fā)作實驗（Metrazol maximalseizure test, MMS),屬癲癇大發(fā)作模型。

巴比妥（barbital)類抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨著劑量的由小到大，中樞抑制作用的程度由淺入深。當(dāng)劑量大于催眠劑量時有抗驚厥bhskgw.cn/sanji/作用。臨床上常利用barbital類這一機(jī)制將其用于小兒高熱、破傷風(fēng)、子癇、腦炎等及中樞興奮藥中毒引起的驚厥。 

【實驗對象】  

小白鼠，體重18～22g。

【實驗藥品與器材】 

生理鹽水（NS)、0.5% 苯巴比妥鈉（sodium phenobarbital)，0.02%地西泮，0.5%戊四氮，小鼠籠、粗天平、1.0ml注射器。生理鹽水。

【實驗觀察指標(biāo)】

觀察每組發(fā)生驚厥的動物數(shù)，計算驚厥百分率，比較給藥組與對照組百分率的差異，以判斷受試藥物有無抗驚厥活性。

小鼠強(qiáng)直性驚厥指標(biāo)：大多數(shù)小鼠給予戊四氮后5～15分鐘內(nèi)出現(xiàn)陣攣性抽搐，或出現(xiàn)興奮性跳躍，隨后出現(xiàn)前肢屈曲，后肢強(qiáng)直，呈角弓反張狀，以其后肢僵直作為驚厥指標(biāo)。

【實驗方法與步驟】

①隨機(jī)分組：取6只小鼠，稱重、編號，隨機(jī)分成3組，每組2只。

②給藥：實驗組ip（腹腔注射)給予0.5%苯巴比妥納0.1ml/10g，地西泮2mg/kg，對照組ip NS 0.1ml/10g。10分鐘后，各組小鼠均ip戊四氮100mg/kg。

③觀察：觀察30min內(nèi)各組小鼠驚厥發(fā)生情況（以后肢伸直為指標(biāo))。

【實驗結(jié)果】 將盡可能多的實驗結(jié)果（全班或更多班級的實驗結(jié)果)匯總起來列表。

將實驗結(jié)果填入表13-4，計算出驚厥發(fā)生率。

【注意事項】

①給藥劑量必須準(zhǔn)確并確認(rèn)注射在腹腔內(nèi)。

②戊四氮ip劑量一般為100mg/kg，最大也可用至150mg/kg。

③觀察指標(biāo)以強(qiáng)直性驚厥出現(xiàn)與否為準(zhǔn)，細(xì)微震顫不作為驚厥指標(biāo)。

【思考題】

①中樞興奮藥有哪些？醫(yī)學(xué)研究中常用哪類中樞神經(jīng)興奮藥制造驚厥模型？為什么？

②苯巴比妥鈉屬于哪類藥物？有哪些藥理作用？

唐圣松  黃紅林