病原生物學(xué)出版教材-文字教材:高級醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(主編)第5章 細菌耐藥性

圖5-4  人類致病菌耐藥性的出現(xiàn)

一、醫(yī)院獲得的耐藥菌

（一)金黃色葡萄球菌

20世紀(jì)50年代最早出現(xiàn)耐青霉素金黃色葡萄球菌（以下簡稱金葡菌)，目前該菌青霉素敏感株已很少。70年代耐酶青霉素和頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐甲氧西林（或苯唑西林)金葡菌（MRSA)感染暴發(fā)流行，80年代波及全球。據(jù)美國疾病控制中心報道,1975年在美國MRSA檢出率為2.4%,1991年高達29%，目前MRSA檢出率占全部金葡菌的20%～50%。MRSA對各種抗生素的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感金葡菌。

1993年北京地區(qū)金葡菌臨床分離株中MRSA占12.2%，1998年上升為29.4%，增長速度居于中等水平，但重癥監(jiān)護病房（ICU)MRSA分離率高達90%。1999年廣州地區(qū)MRSA檢出率為53%。所檢出的MRSA均呈多重耐藥，以耐四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、克林霉素、氨基糖苷類為多，2000年，從全國51家醫(yī)院分離的2191株金黃色葡萄球菌中，MRSA占29.8%。

1984年，喹諾酮類抗菌藥物進入臨床，北京地區(qū)幾乎所有金葡菌分離株對喹諾酮類敏感，到1994年該菌對喹諾酮類的耐藥率為9.5%，1995年竟高達49%，其中MRSA對喹諾酮類的耐藥率可達91%（158/174)。1999年廣州地區(qū)MRSA對環(huán)丙沙星耐藥率高達84%。

有些MRSA菌株對幾乎所有常用β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，僅萬古霉素有效。1997年，在日本和美國等相繼發(fā)現(xiàn)萬古霉素敏感性降低的金黃色葡萄球菌（VISA，MIC為8μg/ml)。VISA感染者患有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病，免疫力低下，因感染MRSA而服用萬古霉素已達半年之久；在病房物品和與患者接觸的醫(yī)務(wù)人員中未檢出VISA，表明VISA產(chǎn)生于抗菌治療過程中。VISA的出現(xiàn)給臨床醫(yī)生敲響了警鐘。目前，我國尚未檢出萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌。

甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS)檢出率更高。在美國，60%～79%表皮葡萄球菌耐甲氧西林。1999年廣州地區(qū)凝固酶陰性葡萄球菌對甲氧西林的耐藥率高達86%，并呈多重耐藥性。2000年對我國51家醫(yī)院共3 619株凝固酶陰性葡萄球菌耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)，MRCNS檢出率高達71.7%。靜脈導(dǎo)管插管的大量使用大大增加了患者感染凝固酶陰性葡萄球菌的機會。

（二)革蘭陰性桿菌

主要是腸桿菌科和假單胞菌屬，包括大腸埃希菌、肺炎克氏菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、鮑氏不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽黃單胞菌和脆弱類桿菌等，其中最為重要的是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL)、AmpC β-內(nèi)酰胺酶和多重耐藥性的革蘭陰性桿菌。在ICU，革蘭陰性桿菌耐藥性問題尤為突出，給臨床抗感染治療帶來很大困難。

產(chǎn)ESBL菌株  隨著第三代頭孢菌素的問世和在臨床上日益廣泛的應(yīng)用，細菌β-內(nèi)酰胺酶編碼基因發(fā)生突變，產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。1982年首先在德國發(fā)現(xiàn)臭鼻克氏菌產(chǎn)生ESBL，它能滅活超廣譜頭孢菌素，包括第一、二代和第三代頭孢菌素（頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松)，以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類（氨曲南)，但對頭霉素和碳青霉烯類敏感。之后，全世界許多地區(qū)不斷有新的ESBL檢出，它可分為TEM/SHV型和非TEM/SHV型二大類，產(chǎn)生菌主要是肺炎克氏菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌。尚未發(fā)現(xiàn)革蘭陽性菌產(chǎn)生ESBL。

1996年，法國某教學(xué)醫(yī)院檢出51%肺炎克氏菌產(chǎn)生ESBL。1998年在美國對9777株革蘭陰性桿菌進行藥敏檢測，大腸埃希菌和肺炎克氏菌對頭孢他啶耐藥率分別為10.3%和23.8%。1999年上海地區(qū)產(chǎn)ESBL腸桿菌科菌檢出率為34.3%，其中以溝腸桿菌、肺炎克氏菌和大腸埃希菌為主，僅對碳青霉烯類（亞胺培南)和頭霉素類（頭孢美唑)高度敏感。同年，廣州地區(qū)產(chǎn)ESBL革蘭陰性桿菌檢出率為38%，其中以大腸埃希菌和肺炎克氏菌多見。目前革蘭陰性桿菌ESBL的攜帶率呈不斷上升趨勢。產(chǎn)ESBL菌常常具有多重耐藥性，包括對氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素、氯霉素等耐藥。

產(chǎn)AmpC酶和碳青霉烯酶菌株  隨著新一代β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌容易在染色體ampC基因調(diào)控下，產(chǎn)生新的β-內(nèi)酰胺酶─AmpC酶。該酶能水解絕大多數(shù)類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素，克拉維酸亦不能抑制其活性，優(yōu)先選擇的底物是第三代頭孢菌素，僅對碳青霉烯類（亞胺培南)和第四代頭孢菌素（頭孢吡肟、頭孢匹羅)敏感。尤其是因完全去抑制突變而高產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的菌株，臨床上可供選擇的β-內(nèi)酰胺類抗生素更少。

陰溝腸桿菌因能產(chǎn)生AmpC酶，已迅速成為越來越重要的醫(yī)院嚴(yán)重感染的病原菌，難治性日益突出，尤其是對免疫力低下的患者。

1988年，從銅綠假單胞菌中分離到含鋅金屬β-內(nèi)酰胺酶，即碳青霉烯酶，能賦予碳青霉烯類、第三代和第四代頭孢菌素耐藥性，但不能滅活氨曲南。近年相繼在嗜麥芽黃單胞菌和脆弱類桿菌中發(fā)現(xiàn)該酶。陰溝腸桿菌和粘質(zhì)沙雷菌亦能產(chǎn)生碳青霉烯酶，但其活性部位不含鋅原子，而是Ser殘基。

多重耐藥菌株  近年來，因外膜蛋白改變和/或主動外排系統(tǒng)作用而呈多重耐藥的革蘭陰性桿菌問題尤為突出。我國學(xué)者在1996～1997年進行了一次為期2年下呼吸道革蘭陰性桿菌（共841株)耐藥性檢測，多重耐藥性發(fā)生率為17%，對4種主要抗生素（第三代頭孢菌素、氨基糖苷類、喹諾酮類和亞胺培南)中的2類產(chǎn)生耐藥性為10%，3類產(chǎn)生耐藥性為6%。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和鮑氏不動桿菌甚至出現(xiàn)耐“全部”抗菌藥物的菌株。近年不動桿菌感染迅速增加，特別是在ICU因使用呼吸機而導(dǎo)致肺炎。該菌對第三代頭孢菌素呈高度耐藥，僅對亞胺培南仍保持較高的敏感性。

近年來，由于氟喹諾酮類藥物廣泛應(yīng)用，大腸埃希菌和銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星的耐藥性發(fā)展速度驚人。據(jù)上海某燒傷研究所報道，銅綠假單胞菌對氧氟沙星的耐藥率從1990～1993年的20.7%上升到1993～1995年的51.5%。2000年，在我國大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的耐藥率已升至50%以上。

嗜麥芽黃單胞菌已成為呼吸ICU下呼吸道感染的常見病原菌，感染率有時高于銅綠假單胞菌。嗜麥芽黃單胞菌外膜通透性低，往往呈高度多重耐藥性，對第三代頭孢菌素、氨基糖苷類、環(huán)丙沙星和亞氨培南呈高度耐藥率，對氨曲南無一敏感，對酶抑制劑無效。目前可選用的抗生素有磺胺類（SMZ/TMP)、多西環(huán)素、替卡西林/克拉維酸。

（三)腸球菌

主要包括糞腸球菌和屎腸球菌，對常用抗菌藥物青霉素、頭孢菌素、克林霉素等具有天然耐性，對氨基糖苷類、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、環(huán)丙沙星等呈獲得性耐藥，多重耐藥腸球菌僅萬古霉素惟一有效藥。1987年，在英國最先發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素腸球菌（VRE)。1989年在美國VRE臨床分離株檢出率不到0.5%，而到1994年上升為14%，短短幾年增加了20多倍，目前，VRE占所有腸球菌分離株的23%。VRE已在全球蔓延，主要引起醫(yī)院感染，暴發(fā)流行多發(fā)生在ICU，病死率高。VRE常呈多重耐藥性。

上海地區(qū)在1996～1998年期間共檢測769株腸球菌，其中VRE占3%。1999年廣州地區(qū)VRE檢出率為9.5%。1999～2001年從我國79家醫(yī)院收集的102株腸球菌臨床分離株對萬古霉素的耐藥率為3.78%�？梢�，目前在我國VRE檢出率不高。但隨著萬古霉素和去甲萬古霉素的廣泛應(yīng)用，VRE感染可能將日趨嚴(yán)重。因此，必須從現(xiàn)在起嚴(yán)格控制萬古霉素的適應(yīng)證，以延緩耐藥性的產(chǎn)生。

VRE的最大危害是可將萬古霉素耐藥基因傳遞給金黃色葡萄球菌、鏈球菌和產(chǎn)單核細胞李氏菌等。由于腸球菌對大多數(shù)抗生素具有耐性，第三代頭孢菌素和抗厭氧菌藥物 (如甲硝唑)的大量應(yīng)用將成為VRE感染的危險因素。

1997年在美國發(fā)生一起萬古霉素依賴型VRE（vancomycin-dependententerococci，VDE)醫(yī)院感染暴發(fā)流行，VDE在不含萬古霉素的培養(yǎng)基上不能生長。

（四)抗酸桿菌

包括結(jié)核分枝桿菌和鳥分枝桿菌。20世紀(jì)80年代后期，結(jié)核病呈再次回升趨勢，目前已成為傳染病中的第一殺手和最大死因，全球每年新增1000萬患者，已有5000萬人攜帶耐藥性結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO1997年公布的35個國家調(diào)查結(jié)果，結(jié)核分枝桿菌的原發(fā)性耐藥率平均為10.4%，獲得性耐藥率高達36%，以耐異煙肼、利福平、鏈霉素等一線藥物為主；多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-TB，通常指至少耐異煙肼和利福平)檢出率高，其中，原發(fā)MDR-TB發(fā)生率平均為1.4%，獲得性MDR-TB發(fā)生率平均為13%。但在過去20年里，多重耐藥結(jié)核分枝桿菌檢出率在英國增長緩慢，1997年僅為1%～2%，原因不清。

1990年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國結(jié)核分枝桿菌原發(fā)耐藥率為28%，獲得性耐藥率為41%，屬高耐藥國家，其中MDR-TB較為嚴(yán)重。廣東省1998年對40個監(jiān)測點分離的1648株結(jié)核分枝桿菌耐藥性分析表明，原發(fā)耐藥率為18%，原發(fā)多重耐藥率為5.3%，獲得性耐藥率為33.7%，獲得性多重耐藥率為15.7%。

隨著艾滋病病毒感染的蔓延和流動人口的增加，多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的發(fā)生及傳播將更為嚴(yán)重。

二、社區(qū)獲得的耐藥菌

經(jīng)呼吸道傳播的主要有肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌和結(jié)核分枝桿菌；經(jīng)糞—口途徑傳播的有志賀菌和沙門菌；通過性接觸傳播的主要是淋病奈瑟菌。

（一)肺炎鏈球菌

肺炎鏈球菌能引起嚴(yán)重的危及生命的疾病，全球每年死亡300～500萬人，其中主要是兒童和老年人。20世紀(jì)40年代，肺炎鏈球菌對最常用的青霉素高度敏感（MIC，＜0.1μg /ml)。60年代在澳大利亞出現(xiàn)青霉素中度敏感株（MIC，0.1～1μg/ml)。70年代末在南非和80年代初在西班牙發(fā)現(xiàn)高水平青霉素耐藥株（penicillinresistant S.pneumoniae，PRSP)（MIC，4～8μg/ml)。90年代耐藥水平繼續(xù)攀升，有的耐藥株MIC竟高出殺死敏感株所需濃度的1000倍。

近年來，PRSP（包括中度敏感菌株)檢出率呈明顯上升趨勢，在多個國家已超過10%。在美國，1989年P(guān)RSP檢出率＜5%；到1996～1997年該菌對青霉素的耐藥率高達34%，其中9%～14%為青霉素高度耐藥株；1998年為29.5%。2001年據(jù)報道我國13家醫(yī)院分離的肺炎鏈球菌中PRSP檢出率為22.5%，其中高度耐藥菌株為2.5%，但對四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶等耐藥情況非常嚴(yán)重。隨著青霉素口服制劑的廣泛應(yīng)用，與PRSP檢出率高達50%～60%大周邊國家和地區(qū)頻繁交往，我國PRSP檢出率將迅速增長。

目前，肺炎鏈球菌流行菌株起源于西班牙，其中MMSp23F株對青霉素、四環(huán)素、氯霉素等呈多重耐藥，MMSp23F變異株對紅霉素及第三代頭孢菌素耐藥。2001年，廣州、北京、上海、西安四地肺炎鏈球菌對紅霉素呈高度耐藥（＞80%)，明顯高于國外大多數(shù)國家。1998年在美國，肺炎鏈球菌對紅霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率分別為19.3%和31%。然而，在加拿大肺炎鏈球菌對以上藥物仍維持較高敏感率。近年來，肺炎鏈球菌對喹諾酮類的耐藥率不斷上升。

尚未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素肺炎鏈球菌。1999年，在116株肺炎鏈球菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)3株萬古霉素耐受株（被10倍MIC濃度藥物抑制而不被殺死)，有可能進一步演變?yōu)槿f古霉素耐藥菌株。

（二)流感嗜血桿菌

20世紀(jì)70年代初，氨芐西林取代氯霉素和四環(huán)素成為治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。1974年首次分離到產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的氨芐西林耐藥株。1980年發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)酶的耐氨芐西林菌株。近20多年來，氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌檢出率逐年增加，遍布全球。

2000年，我國4家醫(yī)院氨芐西林耐藥流感嗜血桿菌檢出率為10.3%（94/916)，與東南亞地區(qū)相當(dāng)。所有耐藥株對第二代頭孢菌素頭孢克洛和第三代頭孢菌素頭孢曲松高度敏感。1995～1997年上海某綜合性醫(yī)院對100多株流感嗜血桿菌檢測發(fā)現(xiàn)，氨芐西林耐藥率為25.5%，較歐美國家的耐藥率高，可能與氨芐西林應(yīng)用頻率較高有關(guān)。此外，流感嗜血桿菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、紅霉素亦產(chǎn)生耐藥。

（三)淋病奈瑟菌

青霉素一直是治療淋病的首選藥物，但到20世紀(jì)70年代中期，出現(xiàn)產(chǎn)青霉素酶的淋病奈瑟菌（penicillinase-producing N.gonorrhoeae,PPNG)。80年代又出現(xiàn)不產(chǎn)青霉素酶的染色體介導(dǎo)的青霉素和四環(huán)素耐藥菌株。PPNG流行率最高的是東南亞，1994年在菲律賓PPNG檢出率高達70.7%，四環(huán)素耐藥率為6.5%。同年在美國PPNG檢出率為15.6%，四環(huán)素耐藥率為21.7%，但對廣譜頭孢菌素大多敏感。2000年，在菲律賓和泰國淋病奈瑟菌分離株對青霉素的耐藥率高達90%，在美國為42%。

我國20世紀(jì)80年代PPNG的檢出率較低。1996～2001年期間，我國學(xué)者分離到794株淋病奈瑟菌，該菌對青霉素的耐藥率由1996年的57.2%上升到2001年的81.8%，對四環(huán)素的耐藥率變化不大，維持在80%左右，并出現(xiàn)同時耐青霉素和四環(huán)素菌株。

由于淋病奈瑟菌對青霉素和四環(huán)素出現(xiàn)耐藥性，使得在治療不復(fù)雜的淋病時不得不首選廣譜頭孢菌素和喹諾酮類等。正因為如此，近年來各地報道的PPNG雖呈下降趨勢，但喹諾酮類耐藥淋病奈瑟菌分離株明顯增多。廣東地區(qū)檢測了1996～1999年期間收集的622株淋病奈瑟菌，對環(huán)丙沙星耐藥率從1996年的17.3%猛增到1999年的78.4%，但對大觀霉素和頭孢曲松的耐藥率較低，因此，這二種藥物仍是目前治療淋病的首選藥物。

（四)志賀菌屬

1959年在日本發(fā)現(xiàn)多重耐藥痢疾志賀菌感染暴發(fā)。1990年布隆迪暴發(fā)流行的痢疾志賀菌對該國所有口服抗生素均呈耐藥。北京地區(qū)在1994～2001年期間共檢測327株志賀菌，1994年該菌對常用抗生素諾氟沙星和環(huán)丙沙星高度敏感，1999～2001年耐藥檢出率分別為6.4%和12.8%，雖低于1997～1998年，但中度敏感菌株檢出率高達29.8%和76.6%，提示志賀菌對喹諾酮類的耐藥性將呈迅速增長趨勢。志賀菌對以前常用的四環(huán)素、氨芐西林、氯霉素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶等耐藥率高，但對氨基糖苷類、頭孢菌素

類呈高敏感性。2001年，上海地區(qū)檢出的60株志賀菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶和氨芐西林耐藥率呈上升趨勢，但對氧氟沙星、第三代頭孢菌素的敏感率一直保持較高水平�？梢�，志賀菌對喹諾酮類的耐藥率與各地使用該類藥物的頻率有關(guān)。

（五)沙門菌

由于抗菌藥物作為生長促進劑在食源性動物中廣泛應(yīng)用，沙門菌耐藥性問題日益嚴(yán)重。例如，1998～2000年，國家細菌耐藥監(jiān)測中心從45家醫(yī)院共收集傷寒和副傷寒沙門菌237株，除磺胺甲噁唑/甲氧芐啶外，該菌對常用抗菌藥物如氯霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和第三代頭孢菌素仍呈高度敏感。而122株非傷寒沙門菌對氨芐西林、四環(huán)素、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的耐藥率高，對環(huán)丙沙星和第三代頭孢菌素的耐藥率呈上升趨勢。不同地區(qū)傷寒沙門菌有其不同耐藥譜。多重耐藥的傷寒沙門菌在部分地區(qū)檢出率較高，最多可耐8種抗生素，使得臨床治療變得極為棘手。

需要特別強調(diào)的是，耐藥菌的出現(xiàn)和變遷與抗生素廣泛應(yīng)用密切相關(guān)（表5-1)。

表5-1  臨床常見耐藥菌及其變遷

第四節(jié)  耐藥性產(chǎn)生的生化機制

抗生素抑制細菌生長或殺死細菌，必須能夠：①穿過細菌外膜或肽聚糖層或細胞膜，到達作用部位；②經(jīng)受各種滅活酶的攻擊；③與參與細菌基本功能的結(jié)構(gòu)相互作用，并充分地抑制該功能。細菌對抗生素耐藥正是在這幾個環(huán)節(jié)上構(gòu)成防御體系的結(jié)果。

一、滅活作用

滅活作用(i醫(yī)學(xué)全.在線nactivation of drug)是細菌產(chǎn)生耐藥性的最重要方式。細菌被誘導(dǎo)產(chǎn)生滅活酶，通過修飾或水解作用破壞抗生素，使之轉(zhuǎn)化成為無活性的衍生物。常見的滅活酶有β-內(nèi)酰胺酶（如青霉素酶、頭孢菌素酶)、氨基糖苷類修飾酶（乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶)、紅霉素酯酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等。

氨基糖苷類修飾酶能將氨基糖甙類抗生素的游離氨基乙�；�，將游離羥基磷酸化、核苷化，使藥物不易進入菌體內(nèi)，也不易與細菌內(nèi)靶位（核糖體30S亞基)結(jié)合，從而失去抑制蛋白質(zhì)合成的能力。

β-內(nèi)酰胺酶可破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)而使β-內(nèi)酰胺類抗生素活性失去或減低，這是大多數(shù)病原菌耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要機制。G^＋菌中只有葡萄球菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，可有效地水解天然和半合成的青霉素類抗生素（苯唑西林和甲氧西林除外)，但對頭孢菌素不起作用。

革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶種類很多，不僅在結(jié)構(gòu)上，而且在底物特異性上各不相同（表5-2)。在活性部位大多數(shù)是Ser殘基，少數(shù)是含鋅金屬酶。其中以TEM-1最普遍，分離陽性率達90%以上。除A類碳青霉烯酶外，均可由質(zhì)粒介導(dǎo)，由染色體介導(dǎo)的有窄譜β-內(nèi)酰胺酶和A類碳青霉烯酶。

表5-2  β-內(nèi)酰胺酶的分類和特性

20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)肺炎克氏菌和大腸埃希菌能產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL)，ESBL屬于窄譜β-內(nèi)酰胺酶TEM-1/TEM-2和SHV-1的衍生物，其中SHV-2呈國際性分布。90年代，法國最先報道銅綠假單胞菌能產(chǎn)生非TEM和非SHV型ESBL，命名為PER-1，之后，相繼在多個國家不同菌種中發(fā)現(xiàn)。非TEM/SHV型ESBL與TEM/SHV型酶僅有25%～38%氨基酸具有同源性。目前ESBL至少有140多種，已在世界各地流行，其中TEM/SHV型ESBL在臨床上檢出率較高。產(chǎn)ESBL細菌對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥（除頭霉素和碳青霉烯類外)。

二、靶位改變

細菌通過產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對抗生素的作用靶位進行化學(xué)修飾，或通過基因突變造成靶位變異（alteration of target site)，使抗菌藥物不能與靶位結(jié)合或親和力下降，失去殺菌作用，但細菌生理功能正常（表5-3)。

表5-3  靶位改變與耐藥性

青霉素結(jié)合蛋白（PBP)  β-內(nèi)酰胺類抗生素與其作用靶位PBP結(jié)合后，可干擾肽聚糖的正常合成，導(dǎo)致細菌死亡。但是，某些G^＋菌（如肺炎鏈球菌)和G^－菌（如淋球菌、銅綠假單胞菌)能改變其PBP的結(jié)構(gòu)，使之與β-內(nèi)酰胺類的親和力降低而導(dǎo)致耐藥。肺炎鏈球菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，PBP發(fā)生改變在耐藥性形成上具有非常重要的作用。

甲氧西林耐藥金葡菌（MRSA)能產(chǎn)生一種新的低分子量PBP-2＇或PBP2a（76kDa)，對所有β-內(nèi)酰胺類抗生素具有低親和性，因而在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在的條件下，雖然細菌表面正常的5種PBP被抑制，不能發(fā)揮正常生理功能，但PBB-2＇不被抑制，可作為轉(zhuǎn)肽酶完成細胞壁的合成，使細菌對β-內(nèi)酰胺類耐藥。萬古霉素中度耐藥金葡菌（VISA)耐藥機制尚不清楚，VISA日本分離株產(chǎn)生3～5倍的PBP2和PBP2a，具有2倍厚的細胞壁，同時削弱了肽鏈之間的連接，提示耐藥性可能與細胞壁的合成有關(guān)。

核糖體  核糖體30S亞基S12蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，鏈霉素失去結(jié)合受體而不能發(fā)揮抑菌作用。肺炎鏈球菌能產(chǎn)生甲基化酶，使23SrRNA上的一個關(guān)鍵性的腺嘌呤殘基甲基化，使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與靶位即核糖體50S亞基結(jié)合力下降而導(dǎo)致耐藥。

二氫葉酸代謝酶  甲氧芐啶（TMP)通過抑制二氫葉酸還原酶（Mr21000)而殺菌，但耐藥菌能產(chǎn)生大量的功能相同的新蛋白（Mr21000)，不被TMP抑制。細菌改變二氫葉酸合成酶構(gòu)型，與磺胺藥的親和力下降100倍，敏感菌轉(zhuǎn)為耐藥菌。

三、藥物累積不足

減少藥物吸收(reduced drug uptake)  由于細胞壁的有效屏障或細胞膜通透性的改變，阻止藥物吸收，使抗生素?zé)o法進入菌體內(nèi)發(fā)揮作用。例如，分枝桿菌的細胞壁存在異常緊密的結(jié)構(gòu)，通透性極低；銅綠假單胞菌外膜上由孔蛋白構(gòu)成的蛋白通道較特殊，通透能力比大腸埃希菌低100多倍，加之生物膜（biofilm)的形成而使抗菌藥物不易進入菌體，故結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌對眾多的抗菌藥物呈現(xiàn)明顯的天然耐藥性。

革蘭陰性菌具有選擇性低通透性的外膜屏障（圖5-6)，微孔蛋白通道對一些抗菌藥物的進入具有阻礙作用，故對許多抗菌藥物產(chǎn)生抗性；而G^＋菌無外膜屏障，對許多疏水性抗生素（如β-內(nèi)酰胺類)更為敏感。在接觸抗生素后，細菌可改變外膜孔蛋白的組成或減少其數(shù)量（如OmpF和OmpC的表達減少)，降低外膜通透性，產(chǎn)生獲得性耐藥，如鼠傷寒沙門菌對多種抗生素耐藥，即為其缺乏蛋白通道。亞氨培南通過特殊通道OprD₂擴散，銅綠假單胞菌因缺乏OprD₂而呈耐藥。

外膜屏障與β-內(nèi)酰胺酶具有明顯的協(xié)同作用，即通透性降低可使有效的酶滅活系統(tǒng)作用加強。

圖5-6  革蘭陽性菌（右)和陰性菌（左)細胞壁結(jié)構(gòu)圖

增加藥物排出(enhanced drug efflux)  近年研究發(fā)現(xiàn)，細菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要原因是，具有能量依賴性的主動外排系統(tǒng)，可將不同結(jié)構(gòu)的抗生素（如氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等)同時泵出體外，使菌體內(nèi)的抗生素濃度明顯降低，不足以殺死細菌。細菌還具有僅排出一種或一類抗菌藥物的“單”耐藥系統(tǒng)，如最早發(fā)現(xiàn)的大腸埃希菌四環(huán)素主動外排泵，能通過質(zhì)膜蛋白TetA利用跨膜氫離子梯度，即質(zhì)子驅(qū)動力（protonmotive force，PMF)作為能量，將累積到一定濃度的四環(huán)素泵出胞外，阻止它作用于靶位核糖體。

根據(jù)組成和外排機制，主動外排系統(tǒng)可分為主要易化家族、腫瘤耐藥性調(diào)節(jié)分化家族、葡萄球菌多重耐藥家族和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運器；按能量依賴形式，可分為二類：①具有2個跨膜單位和2個ATP結(jié)合單位，利用ATP-Na^＋-K^＋泵作動力；②單跨膜單位，利用質(zhì)子泵作動力進行反向轉(zhuǎn)運。

主動外排系統(tǒng)通常由外排轉(zhuǎn)運蛋白、外膜通道蛋白和連接蛋白（或輔助蛋白)三部分組成。例如，銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排系統(tǒng)包括（圖5-7)：①MexB：具有主動轉(zhuǎn)運功能，鑲嵌在細胞膜；②OprM：位于細胞外膜，具有孔蛋白的作用；③MexA：為輔助蛋白，存在于外膜和膜之間，起連接MexB和OprM的作用。

圖5-7  多重耐藥菌主動外排泵模式圖

β-內(nèi)酰胺類抗生素經(jīng)外膜孔蛋白進入膜間隙，結(jié)合于細胞膜外側(cè)，可被MexB捕獲，借助MexA輔助蛋白的橋聯(lián)作用，經(jīng)OprM排出菌體。非β-內(nèi)酰胺類抗生素經(jīng)外膜孔蛋白進入膜間隙后，通過擴散等過程穿過細胞膜進入菌體，MexB可以在細胞膜內(nèi)側(cè)捕獲這些抗生素，經(jīng)過MexA和OprM排到協(xié)同作用細胞外。

MexAB-OprM等主動外排系統(tǒng)與外膜通透性降低的協(xié)同作用，使得銅綠假單胞菌對多種類型的抗菌藥物耐藥，

具有抗菌藥物主動外排系統(tǒng)的病原菌主要是：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克氏菌、流感嗜血桿菌、空腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌和結(jié)核分枝桿菌等，常見的細菌主動外排系統(tǒng)有大腸埃希菌TetA、AcrAB，金黃色葡萄球菌NorA，銅綠假單胞菌MexAB-OprM，淋球菌MtrCDE等。但傷寒沙門菌、志賀菌未見主動外排系統(tǒng)，這可能是這兩種病原菌耐藥性上升較為緩慢的原因。目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠泵出氨基糖苷類抗生素的主動外排系統(tǒng)，可能與其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

四、其他

細菌可通過增加抗菌藥物作用靶位的產(chǎn)量而耐藥，如磺胺類耐藥金黃色葡萄球菌對氨基苯甲酸產(chǎn)量可為敏感株的20倍。

值得注意的是，細菌對某一抗菌藥物可能存在多種耐藥機制（表5-4)。

表5-4  細菌對常用抗生素的耐藥機制

第五節(jié)  耐藥性產(chǎn)生的遺傳（分子)機制

細菌耐藥性可分為固有耐藥和獲得性耐藥，前者是由細菌染色體基因決定的，可代代相傳；后者是通過染色體基因突變或耐藥基因轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生，其中，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性遠比染色體介導(dǎo)的耐藥性普遍，主要原因是：

（1)當(dāng)細菌在無抗生素環(huán)境中生長時，耐藥基因顯然是不重要的。為減少遺傳和生理負荷，耐藥基因保持在質(zhì)粒上是明智的，這樣并不需要某一菌種的所有成員都保持一個特定的R質(zhì)粒，只需少數(shù)細菌攜帶R質(zhì)粒，在抗生素應(yīng)用選擇壓力下，可確保攜帶R質(zhì)粒的菌株存活，維持繁衍。

（2)質(zhì)粒除了垂直傳播外，易在同一菌種和不同種屬之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，因此，耐藥基因在質(zhì)粒上比在染色體上更易于快速轉(zhuǎn)移。

（3)質(zhì)粒通常是轉(zhuǎn)座子和整合子的載體，而轉(zhuǎn)座子和整合子常常攜帶耐藥基因。

一、固有耐藥

細菌染色體上帶有編碼耐藥性的基因。細菌耐藥基因可能起源于產(chǎn)生抗生素的微生物，但不是唯一來源。細菌看家基因（housekeeping gene)編碼產(chǎn)物如糖激酶、蛋白激酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶在長期進化過程中演變?yōu)榘被�糖苷類修飾酶等。固有耐藥具有種屬特異性，如多數(shù)革蘭陰性菌耐萬古霉素和甲氧西林，腸球菌耐頭孢菌素，厭氧菌耐氨基糖苷類藥物等。

二、基因突變

染色體發(fā)生基因突變（gene mutation)可使細菌獲得耐藥性。細菌耐藥性自發(fā)突變的頻率通常為10^-10～10^-7，即當(dāng)一個細菌分裂成10⁷～10¹⁰子代才有一次突變出現(xiàn)，可能產(chǎn)生對某一抗生素的耐藥現(xiàn)象。由突變產(chǎn)生的耐藥性一般只對一種或兩種相類似的藥物耐藥，且比較穩(wěn)定。細菌耐藥性基因突變是隨機發(fā)生的。發(fā)生突變的細菌事實上只是大量菌群中的極個別菌，并且耐藥菌生長較慢，因此，在自然界中耐藥菌僅居次要地位。

基因突變在耐藥性發(fā)展上起有非常重要作用，如產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性菌、耐多藥結(jié)核分枝桿菌等均與基因突變密切相關(guān)，將在本節(jié)末詳述，現(xiàn)以氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥加以說明。

DNA解旋酶  革蘭陰性菌（如大腸埃希菌、淋球菌)對氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥主要與DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基（GyrA)的基因突變有關(guān)。gyrA基因位于染色體上。采用PCR─直接測序法研究發(fā)現(xiàn)，在gyrA基因5＇端存在一個基因突變熱區(qū),即喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinoloneresistance determing region,QRDR)，與氟喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。QRDR負責(zé)編碼GyrA N端靠近催化活性部位122位Tyr的一段氨基酸。QRDR發(fā)生基因突變，則不能產(chǎn)生完整的GyrA亞基，或GyrA亞基發(fā)生氨基酸替換。

比較不同的氟喹諾酮類耐藥病原菌QRDR編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致細菌對喹諾酮類敏感性下降或完全耐藥的最為關(guān)鍵的突變熱點是，對應(yīng)于大腸埃希菌GyrA的第83位Ser和第87位Asp。大多數(shù)引起耐藥性的突變發(fā)生在DNA旋轉(zhuǎn)酶二聚體界面和與抗菌藥物的結(jié)合位點。第83、87等位點的氨基酸替換導(dǎo)致GyrA構(gòu)型的改變，進而影響到與氟喹諾酮類藥物的結(jié)合，或干擾藥物-GyrA酶-DNA相互作用，產(chǎn)生耐藥性。

近年發(fā)現(xiàn)，革蘭陽性球菌（如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌)對氟喹諾酮類耐藥主要與DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅳ基因突變密切相關(guān)。金黃色葡萄球菌（GrlA) 第80位Ser和84位Glu的密碼子的突變，對喹諾酮類耐藥性的形成最為重要。

核糖體50S亞基  細菌核糖體50S亞基發(fā)生基因突變，使大環(huán)內(nèi)酯類藥物不能與之結(jié)合，因而不能發(fā)揮抗菌作用。例如，目前臨床上常用含克拉霉素的短程三聯(lián)療法根除幽門螺桿菌，但克拉霉素耐藥菌株的出現(xiàn)將導(dǎo)致療效降低或治療失敗。應(yīng)用基因分型法，比較治療前從患者體內(nèi)分離的克拉霉素敏感株與治療后的克拉霉素耐藥株，結(jié)果二者DNA指紋相同，提示突變株來自同一個克隆，并非感染新的菌株。用PCR擴增幽門螺桿菌23SrRNA基因，再進行限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP)分析或直接測序，發(fā)現(xiàn)在耐藥株23SrRNA基因2143和2144殘基上存在A→G點突變，2143上還存在A→C點突變，表明幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性與23SrRNA基因點突變密切相關(guān)。

三、基因轉(zhuǎn)移

耐藥菌株（供體菌)可將耐藥基因轉(zhuǎn)移至敏感菌株（受體菌)中，使后者獲得耐藥性�；�因轉(zhuǎn)移(gene transfer)是細菌耐藥性迅速擴散的主要原因。攜帶耐藥基因的基因轉(zhuǎn)移元件主要有質(zhì)粒（plasmid)、接合型轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn)和整合子（integron)。耐藥基因在細菌間可通過接合（conjugation)、轉(zhuǎn)化(transformation)、轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)和轉(zhuǎn)座(transposition)方式轉(zhuǎn)移。

（一)接合

質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移  質(zhì)粒是細菌染色體外的遺傳物質(zhì)，大多由閉合環(huán)狀的雙鏈DNA組成。質(zhì)粒具有自我復(fù)制的能力，所攜帶的基因往往賦予宿主菌新的生物學(xué)性狀，增加細菌在不利環(huán)境下的存活機會。

兩個細菌通過性菌毛直接接觸，供體菌將質(zhì)粒（或染色體)DNA轉(zhuǎn)移給受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀，這一現(xiàn)象稱為接合（conjugation)。G^＋菌之間亦可發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，但與菌毛無關(guān)，而是受體菌首先分泌一些物質(zhì)，誘導(dǎo)供體菌產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)（凝集因子)，將兩個細菌聚集在一起，然后形成DNA轉(zhuǎn)移所需的小孔。

圖5-8  R質(zhì)粒及其接合轉(zhuǎn)移示意圖

耐藥性質(zhì)粒  亦稱R質(zhì)粒（resistanceplasmid)，可存在于G^－菌和G^＋菌中，最先在志賀菌中發(fā)現(xiàn)。R質(zhì)粒至少由兩部分構(gòu)成（圖5-8)：① 耐藥傳遞因子（resistancetransfer factor)，能編碼性菌毛，決定自主復(fù)制與接合轉(zhuǎn)移；② 耐藥決定因子(resistance determinats)，含耐藥基因，能賦予宿主菌的耐藥性。

r決定子可有多個轉(zhuǎn)座子（Tn)或耐藥基因盒（resistancegene cassetts)連接相鄰排列，構(gòu)成一個多耐藥基因的復(fù)合體，這是造成多重耐藥的原因。例如，陰溝腸桿菌攜帶一個69kb多重耐藥性質(zhì)粒pBWH301，包含4個耐藥基因，其中aacA和aadB編碼氨基糖苷類抗生素（如阿米卡星、慶大霉素等)耐性，sull和chl分別決定磺胺藥物和氯霉素耐性。目前，多重耐藥（氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺藥物)的沙門菌、志賀菌、變形桿菌等革蘭陰性桿菌已大量存在于人及動物腸道中。

R質(zhì)粒從耐藥菌傳遞給敏感菌，使后者變?yōu)槟退幘�。R質(zhì)粒不僅在同一種屬細菌間轉(zhuǎn)移，而且可在不同種屬細菌間互相傳遞，從而造成耐藥性的廣泛傳播。R質(zhì)粒以接合方式傳遞耐藥性在G^－菌尤其是腸道桿菌中比較普遍。研究發(fā)現(xiàn)，不同大腸埃希菌菌株之間能發(fā)生R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移；傷寒沙門菌能將R質(zhì)粒傳遞給大腸埃希菌，反過來，大腸埃希菌也可將不同來源的R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給傷寒沙門菌和痢疾桿菌。大腸埃希菌比其它致病菌更易接受R質(zhì)粒，已成為人和動物體內(nèi)耐藥基因儲存庫。動物間的腸道細菌亦存在廣泛的耐藥基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，且動物的耐藥菌又有可能傳遞給人。帶有多個耐藥基因的R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移導(dǎo)致多重耐藥的腸道桿菌日益增加，給臨床治療帶來很大困難。

    （二)轉(zhuǎn)化

耐藥菌（供體菌)死亡溶解后釋放出的DNA片段進入敏感菌（受體菌)體內(nèi)，其耐藥基因與敏感菌中的同源基因重組，使敏感菌轉(zhuǎn)呈耐藥。由于進入敏感菌體內(nèi)的DNA量很少，因此很少有2種或2種以上耐藥基因同時轉(zhuǎn)移。

直接的DNA轉(zhuǎn)化可發(fā)生在抗感染治療的過程中。有研究表明，釋放到環(huán)境中的DNA很穩(wěn)定，具有穿透細胞膜而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的能力。

（三)轉(zhuǎn)導(dǎo)

轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)是指以溫和噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)。溫和噬菌體感染細菌后不增殖，不裂解細菌，但核酸整合到細菌染色體DNA上，成為細菌DNA的一部分，與細菌染色體一起復(fù)制，當(dāng)細菌分裂時又能傳至子代細菌（圖5-9)。整合到細菌染色體上的噬菌體核酸稱為前噬菌體(prophage)，帶有前噬菌體的細菌稱為溶原性細菌(lysogenicbacterium)。

少數(shù)溶原性細菌的前噬菌體可從染色體上脫離，進行增殖，裝配成新的子代噬菌體，使細菌裂解，轉(zhuǎn)變成溶菌周期。大約在10⁵～10⁷次裝配中發(fā)生一次錯誤，將大小合適的供體菌DNA片段誤裝入噬菌體頭部蛋白質(zhì)外殼中，成為“假噬菌體”或轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。當(dāng)再度感染受體菌時，可將供體菌DNA帶入受體菌內(nèi)（圖5-9)。

圖5-9  普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

與轉(zhuǎn)化方式相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)可轉(zhuǎn)移更大片段DNA，而且由于包裝在噬菌體的蛋白質(zhì)外殼中，可免受DNA酶降解，故DNA轉(zhuǎn)移效率高。由于噬菌體有特異性，故耐藥性轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)象僅能發(fā)生在同種細菌內(nèi)。

轉(zhuǎn)導(dǎo)是金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移耐藥性的重要方式。例如，金葡菌對芐星青霉素耐藥的主要機制是質(zhì)粒介導(dǎo)的青霉素酶，但這類質(zhì)粒不像革蘭陰性菌的R質(zhì)粒是由RTF傳遞的，而是通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式將耐藥性轉(zhuǎn)移到敏感菌。金葡菌對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素、氯霉素、四環(huán)素和紅霉素等的耐藥基因，也可以噬菌體為媒介傳遞給敏感菌。

此外，轉(zhuǎn)座子和整合子也可經(jīng)溫和噬菌體這一載體轉(zhuǎn)移。

（四)轉(zhuǎn)座

轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)機制難以解釋耐藥基因的可移動性及染色體基因插入質(zhì)粒的頻率，因為基因重組常常僅在具有高度同源性的DNA區(qū)域之間發(fā)生，這提示還存在其他的基因轉(zhuǎn)移元件，即轉(zhuǎn)座子和整合子。

轉(zhuǎn)座子  是一個DNA片段，可在質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體之間隨機轉(zhuǎn)移（即插入或切離)，故稱之為“跳躍基因元件”。轉(zhuǎn)座子在質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體之間的自行轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，稱之為轉(zhuǎn)座。

最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子（Tn)是在R質(zhì)粒上帶有抗藥基因的Tn。與質(zhì)粒不同，轉(zhuǎn)座子不能獨立復(fù)制，必須依附在染色體、質(zhì)�；蚴删�體上與之同時復(fù)制。轉(zhuǎn)座子大小為2000～8 000bp，在結(jié)構(gòu)上分為二個部分（圖5-13)：中心序列和2個末端反向重復(fù)序列。中心序列帶有遺傳信息，包含3個主要的功能基因，即：①tnpA基因：負責(zé)編碼轉(zhuǎn)座酶（整合酶)。該酶能特異識別Tn及其受體靶位點兩端的DNA序列，使Tn與靶點序列交錯接合；②tnpR基因：編碼產(chǎn)物具有解離酶和抑制tnpA與tnpR轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白的功能；③結(jié)構(gòu)基因：決定細菌的耐藥性和某些毒力因子，通常帶有一種或多種耐藥基因。

轉(zhuǎn)座子通常整合在細菌基因組中。轉(zhuǎn)移時，首先自行剪切形成一個不能復(fù)制的環(huán)狀中間體，整合到載體質(zhì)�；蚴删�體上，然后經(jīng)接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)方式轉(zhuǎn)移至受體菌。如果載體在新宿主中不能復(fù)制和生存，轉(zhuǎn)座子則可能整合到受體菌基因組中。

轉(zhuǎn)座子插入某一基因時，一方面可引起插入基因失活產(chǎn)生基因突變，另一方面在插入部位又引入一個或多個耐藥基因，使細菌產(chǎn)生耐藥性或多重耐藥性。轉(zhuǎn)座子可在質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體之間容易發(fā)生自行轉(zhuǎn)移，不需要核苷酸堿基對同源就能插入；宿主范圍很廣，可在G^－菌和G^＋菌之間轉(zhuǎn)移，故而促進耐藥性的產(chǎn)生和迅速擴散。

整合子  是大小為800～3 900bp的可移動的基因元件，含有位點特異性重組系統(tǒng)決定子，能捕獲外源基因，尤其是抗生素耐藥基因。整合子由5＇端高度保守的核心區(qū)和3＇端高度可變的結(jié)構(gòu)基因區(qū)組成，前者編碼DNA整合酶，并包括attI重組位點，后者包括1個或多個基因盒（genecassetts)的中心序列（圖5-9)。許多耐藥基因，如編碼氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素、TMP等耐性的基因，以插入形式存在于整合子中，這些耐藥基因包含在可移動的基因盒中。

圖5-9 整合子結(jié)構(gòu)圖

基因盒含有耐藥基因和位于3＇末端的59堿基單元（59base element,59be)（圖5-9)59be亦稱為重組位點，是不完全的反向重復(fù)序列。不同基因盒的重組位點在序列和長度上不盡相同，但都具有末端重復(fù)序列，能被整合子編碼的DNA整合酶所識別，在基因捕獲過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。通過位點特異性重組，基因盒能插入到整合子的DNA整合酶基因鄰近的attI（Int特異重組)位點，成為整合子的組成部分，因此，耐藥基因盒可從一個整合子轉(zhuǎn)移到另一個整合子，使整合子中耐藥基因不斷積累，成為多重耐藥整合子。

基因盒的起始密碼子位于盒的一端，通常不含啟動子，但可從整合子的一個共同啟動子P_ant開始表達。P_ant在整合子的保守區(qū)內(nèi)，大小為214bp，位于基因盒5＇端。耐藥基因的表達受啟動子變異和基因盒插入部位的影響。

自然界存在的整合子對所插入基因盒的數(shù)量和次序沒有任何限制，而基因盒又是分散的遺傳單位，能被整合酶單獨移動，因此，整合子插入?yún)^(qū)域的基因盒排列能通過剪接、重組或插入而發(fā)生改變。正是由于堿基序列的重新組合，導(dǎo)致耐藥基因擴大，細菌的耐藥水平不斷提升。通過轉(zhuǎn)座方式，整合子和轉(zhuǎn)座子可導(dǎo)致在單個質(zhì)粒中多個耐藥基因聚集成簇，這是多重耐藥菌株產(chǎn)生的重要原因，

目前已鑒定出40多種抗生素耐藥基因盒，可以整合到整合子中。研究表明，許多臨床分離菌株都帶有整合子，如整合子可介導(dǎo)傳播超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL)編碼基因。整合子常存在于臨床耐藥菌株質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子上，能在不同細菌之間轉(zhuǎn)移，近年來已經(jīng)在醫(yī)院蔓延，它們的出現(xiàn)已削弱許多抗生素的有效性。

總之，自然界（包括人體正常菌群)肯定存在一個相當(dāng)大的抗生素耐藥基因（或與之密切相關(guān)的基因)庫，細菌復(fù)制子及其宿主菌之間的“基因流”很可能是經(jīng)常性的而不是偶然的，以便對外界環(huán)境變化作出快速反應(yīng)。當(dāng)病原菌暴露于強大的抗生素選擇壓力下，即處于生死關(guān)頭，這一基因庫隨時對細菌開放，使細菌迅速攝取耐藥基因獲得耐藥性，渡過不良環(huán)境。不難想象，在微生物王國，耐藥基因的水平傳播（耐藥基因轉(zhuǎn)移)和垂直傳播（耐藥菌克隆擴散)十分頻繁。

四、耐藥基因轉(zhuǎn)移元件的穩(wěn)定性

盡管獲得新的耐藥基因是耐藥菌株增多的一個重要因素，但關(guān)鍵的是耐藥基因轉(zhuǎn)移元件的穩(wěn)定性。耐藥基因轉(zhuǎn)移元件能迅速適應(yīng)新的宿主，甚至在無抗生素選擇壓力時也不易丟失，這或許能解釋耐藥性日益增多而難以逆轉(zhuǎn)的原因之一。

在抗生素選擇壓力不存在時，R質(zhì)粒保持穩(wěn)定的策略之一是，同時攜帶能賦予另一選擇優(yōu)勢的基因（如編碼能增強定植能力的酶)，從而為耐藥基因的穩(wěn)定提供一個長期選擇壓力。整合子的存在對質(zhì)粒穩(wěn)定也十分重要。整合子含有參與基因位點特異性整合的整合酶和啟動子，為外來基因盒提供一個整合位點，以捕獲外源耐藥基因，產(chǎn)生多重耐藥性。整合子的中心序列不僅有抗生素耐藥基因，而且常常有重金屬耐性基因，因此，重金屬污染或牙科填充物汞合金也能提供選擇壓力，在無抗生素應(yīng)用時得以保持質(zhì)粒及其基因簇的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)座子在大多數(shù)宿主中相當(dāng)穩(wěn)定，原因可能是，轉(zhuǎn)座子不能自我復(fù)制，而是整合到宿主基因組中，并可進行基因重排。

自然界中分離獲得的耐藥菌株耐藥性的穩(wěn)定性似乎已成定論，微生物產(chǎn)生的耐藥突變很可能在進化歷程中很難回復(fù)成為敏感菌株，如肺炎鏈球菌在無抗生素選擇性培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)數(shù)百代后，仍然保持多重耐藥性，這提示阻止耐藥性最好時機是細菌產(chǎn)生耐藥性之前，即第一時間阻止耐藥基因的獲得。采取措施越早，細菌耐藥性發(fā)展越慢。

五、一些重要病原菌的耐藥分子機制

（一)結(jié)核分枝桿菌

迄今未發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌由質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)耐藥的報道，故染色體介導(dǎo)的耐藥性顯得十分重要。結(jié)核分枝桿菌對不同藥物耐藥突變的染色體位點互不相連，不會因某位點突變而產(chǎn)生多重耐藥菌株，因此，染色體多個耐藥基因突變的逐步累加是多重耐藥結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。由于單藥治療、藥物劑量不足及不規(guī)則用藥，可使結(jié)核分枝桿菌敏感菌株在幾個月內(nèi)對多個藥物轉(zhuǎn)呈耐藥。

對異煙肼（INH)耐藥  與一個或多個基因的突變有關(guān)，包括katG（編碼過氧化氫-過氧化物酶)、inhA（編碼烯�；鵨noyl-ACP還原酶)和kasA（編碼β-酮�；�載體蛋白合成酶)等。KatG、InhA和KasA與分枝菌酸生物合成有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌攝取INH后，KatG氧化INH，形成活性中間產(chǎn)物，后者可抑制enoyl-ACP還原酶的活性，導(dǎo)致細胞壁中分枝菌酸合成減少；INH亦可通過與KasA結(jié)合，干擾分枝菌酸的合成，引起細菌死亡。

katG基因大小為4 795bp。采用PCR-SSCP法研究發(fā)現(xiàn)，部分INH高耐藥菌株的katG基因完全缺失，但大部分INH耐藥菌株在katG的中心部位有突變，從而導(dǎo)致在酶活性上起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基發(fā)生改變（主要是羧基端Arg⁴⁶³→Leu和氨基端Ser³¹⁵→Thr)，KatG的活性降低或喪失，INH不能轉(zhuǎn)化為活性形式�？梢姡�katG基因完全缺失和突變是結(jié)核分枝桿菌INH耐藥的分子機制之一。

在約25%IHN耐藥菌株中，發(fā)現(xiàn)inhA調(diào)節(jié)基因序列突變，可能使enoyl-ACP還原酶過度表達，其數(shù)量超過了INH抑制作用，故產(chǎn)生耐藥。

在KatG和inhA基因均未發(fā)生突變的INH耐藥菌株中，kasA基因存在突變，干擾INH與KasA的結(jié)合，分枝菌酸得以合成，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。

KatG、醫(yī)學(xué)三基inhA和kasA基因突變可解釋80%結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐INH機制，但仍有20%耐INH菌株這三個基因均未發(fā)生變異。

對利福平耐藥  與幾乎所有耐利福平細菌一樣，97%結(jié)核分枝桿菌臨床分離株也是由于編碼RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因突變，使該酶不再與利福平結(jié)合而耐藥。在rpoB基因中央附近69bp的高變區(qū)域內(nèi)，存在35種以上不同的錯義突變，其中以Ser⁵³¹→Leu和His⁵²⁶→Tyr的2種突變最為常見，約占總突變65%以上。

對鏈霉素耐藥  鏈霉素不可逆地結(jié)合在核糖體30S亞基（包括16SrRNA和核糖體蛋白S12某個位點)，從而阻止細菌蛋白質(zhì)合成的起始。結(jié)核分枝桿菌對鏈霉素耐藥大多是由于rrs（編碼16SrRNA)和rpsL（編碼S12蛋白)基因發(fā)生突變所致。這二個基因突變使16SrRNA和S12蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，前者多發(fā)生在530環(huán)區(qū)和第904位堿基，后者主要是Lys^43/88→Arg，從而破壞了鏈霉素與16SrRNA和S12的相互作用，導(dǎo)致耐藥。

對吡嗪酰胺耐藥  吡嗪酰胺在細胞內(nèi)酸性環(huán)境中經(jīng)吡嗪酰胺酶作用轉(zhuǎn)變成吡嗪酸而發(fā)揮殺菌作用。大多數(shù)吡嗪酰胺耐藥株吡嗪酰胺酶編碼基因pncA發(fā)生改變，包括核苷酸丟失、插入、轉(zhuǎn)換或顛換，使酶活性喪失或降低。pncA基因突變的位點高達100多個，且呈彌散分布。

（二)產(chǎn)ESBL腸桿菌科

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL)產(chǎn)生的分子機制仍不十分明確，可能涉及：

（1)基因突變：某些窄譜β-內(nèi)酰胺酶可通過耐藥結(jié)構(gòu)基因或其側(cè)翼調(diào)控序列的突變，產(chǎn)生ESBL。TEM/SHV型ESBL來源于母體酶TEM-1和SHV-1。比較大腸埃希菌ESBL和70%青霉素耐藥菌株野生型β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在活性部位（或與之相鄰部位)通常僅存在1～3處差異（表5-5)，如β-內(nèi)酰胺酶SHV-1活性部位1個氨基酸的置換后即變?yōu)槌瑥V譜β-內(nèi)酰胺酶SHV-2，能滅活第三代頭孢菌素。ESBL基因克隆和測序結(jié)果表明，氨基酸改變是β-內(nèi)酰胺酶基因發(fā)生點突變的結(jié)果。因此，編碼β-內(nèi)酰胺酶基因的1個堿基變化，往往使得價值超億美元的醫(yī)學(xué)研究成果化為烏有。

β-內(nèi)酰胺酶容易發(fā)生基因突變的可能原因是，β-內(nèi)酰胺酶只有1個活性部位，不需要與任何輔助因子相互作用，而其他的抗生素修飾酶通常有2個活性結(jié)合部位。

表5-5  超廣譜β－內(nèi)酰胺酶活性部位的氨基酸改變

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氨基酸所處位置

   β－內(nèi)酰胺酶  ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

  39 104   164   205   237   238   240   265  

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   TEM-1*  Gln   Glu   Arg   Gln   Ala   Gly   Glu   Thr

   TEM-2*     Lys  

  TEM-3   Lys   Lys  Ser  

   TEM-4   Lys  Ser  Met

   TEM-6   Lys   His

   TEM-17  Lys

   TEM-19 Thr

   SHV-1*  Gln   Asp   Arg   Arg   Ala   Gly   Gla   Leu

  SHV-2  Ser

    SHV-3  Leu  Ser

   SHV-4  Leu  Ser   Lys 

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  *：親本型，缺乏超廣譜酶活性

（2)基因轉(zhuǎn)移：絕大多數(shù)ESBL由轉(zhuǎn)座子編碼產(chǎn)生，少數(shù)由整合子編碼。該轉(zhuǎn)座子定位于一個可自行移動的R質(zhì)粒上。轉(zhuǎn)座子能以轉(zhuǎn)座方式插入到不同質(zhì)粒中，之后，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，ESBL編碼基因容易在同種或不同種屬的G^－菌之間傳播。從同時期不同感染個體、不同種屬或不同基因型菌株中可分離到相同耐藥質(zhì)粒，臨床上常見的腸桿菌科致病菌均可攜帶編碼ESBL的R質(zhì)粒，提示接合性質(zhì)粒在介導(dǎo)ESBL的傳播中發(fā)揮重要作用。但亦有少數(shù)攜帶ESBL基因的質(zhì)粒為非接合性質(zhì)粒。

ESBL產(chǎn)生菌存活時間較長，可籍人類活動在同一醫(yī)院或不同醫(yī)院傳播，甚至造成更遠距離傳播。產(chǎn)ESBL菌曾在歐洲引起暴發(fā)感染，因缺乏有效藥物難以控制。

（三)耐青霉素肺炎鏈球菌

肺炎鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類耐藥不由質(zhì)粒介導(dǎo)，亦不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，主要是由于青霉素結(jié)合蛋白（PBP)發(fā)生改變，導(dǎo)致PBP與抗生素的親和力下降所致。肺炎鏈球菌含有6種PBP，即PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b、PBP2x和PBP3，在青霉素耐藥菌株（PRSP)中，至少有3種PBP與青霉素的親和力下降，即PBP1a、PBP2b和PBP2x，對超廣譜頭孢菌素耐藥主要涉及PBP1a和PBP2x。突變主要發(fā)生在PBP的青霉素結(jié)合區(qū)，PBP結(jié)構(gòu)和種類變化越大，耐藥水平越高。

低親和力的PBP是由變異的pbp基因編碼。DNA序列分析顯示，所有青霉素敏感株的pbp1a、pbp2b和pbp2x基因序列完全相同，而耐藥菌株則各不相同，例如，不同的PRSP南非分離株的pbp2b基因有多個DNA片段發(fā)生替換（圖5-10)，DNA序列差異高達25%。變異的pbp基因呈“鑲嵌（mosaic)”結(jié)構(gòu)。這些高度變異區(qū)與青霉素耐藥草綠色鏈球菌pbp基因相對應(yīng)區(qū)具有高度同源性。

圖5-10  鑲嵌型和野生型pbp2b基因的比較

［注：陰影區(qū)域：供體菌耐藥基因；空心區(qū)域：野生型DNA；a：肺炎鏈球菌青霉素敏感株pbp2b基因；b：草綠色鏈球菌pbp基因（陰影區(qū)域)；c～h：PRSP菌株鑲嵌型pbp2b基因］

pbp基因改變的廣泛性用獨立的基因突變累積難以解釋，提示肺炎鏈球菌可能通過自然轉(zhuǎn)化方式，從親源關(guān)系近的青霉素耐藥的口腔血鏈球菌、緩癥鏈球菌和草綠色鏈球菌中直接攝取突變的pbp基因片段，通過基因重組，形成鑲嵌pbp基因，即青霉素敏感株的部分pbp基因被來自耐藥株同源序列所代替。草綠色鏈球菌pbp基因在轉(zhuǎn)化到青霉素敏感肺炎鏈球菌之前，可能通過發(fā)生點突變而產(chǎn)生耐藥性。

可以推斷，鑲嵌型耐藥基因僅見于對轉(zhuǎn)化具有自然能力的菌種，如肺炎鏈球菌和奈瑟球菌。鏈球菌具有高度的自溶性，溶解后釋放的DNA進入周圍環(huán)境。另外，在鼻咽部鏈球菌混合感染現(xiàn)象相當(dāng)普遍，為肺炎鏈球菌pbp耐藥基因多樣性的產(chǎn)生提供了可能性。由于鑲嵌基因可能含有不同供體的DNA，所編碼的PBP不同于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a。

肺炎鏈球菌對青霉素呈高水平耐藥，原因就在于形成鑲嵌pbp基因，編碼多種與青霉素親和力下降的PBP，需要更高濃度的青霉素才能有效抑制PBP的功能。在青霉素廣泛應(yīng)用選擇壓力下，鑲嵌pbp基因能通過轉(zhuǎn)化方式水平轉(zhuǎn)移到敏感菌株中（水平傳播)，或耐藥菌株的克隆傳播（垂直傳播)，加速PRSP菌株在全球流行。

（四)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐藥基因  MRSA對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制主要是產(chǎn)生PBP2a。研究發(fā)現(xiàn)，MRSA臨床分離株染色體上均帶有甲氧西林耐藥基因mec。mec大小為30～50kb，是一段非金葡菌DNA，可能是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)座方式整合到金葡菌染色體上。mec基因的整合具有位置和方向的特異性，均插入在SmaI-G段上編碼A蛋白的spa基因和嘌呤生物合成所必須的purA基因之間（圖5-11)。

mec基因主要由調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因組成（圖5-11)，其中結(jié)構(gòu)基因mecA長2130bp，為高度保守DNA片段，負責(zé)編碼PBP2a。完整的mecA為表達高水平甲氧西林耐藥性所必需。當(dāng)Tn551插入mecA時，甲氧西林耐藥株則轉(zhuǎn)變成敏感株。

圖5-11  mec基因結(jié)構(gòu)及染色體定位

mecA基因表達受調(diào)節(jié)基因mecR1-mecI、blaR1-blaI等共同控制。blaR1-blaI基因定位于β-內(nèi)酰胺酶基因（bla)的上游區(qū)，調(diào)節(jié)bla基因和mecA基因的轉(zhuǎn)錄表達，這與MRSA對β-內(nèi)酰胺類高度耐藥及多重耐藥有關(guān)。mecR1-mecI基因定位于mecA基因上游區(qū)，mecR1負責(zé)編碼誘導(dǎo)因子MecR1，mecI則編碼抑制因子MecI。MecI蛋白結(jié)合到mecA基因的啟動子部位，使mecA基因不被轉(zhuǎn)錄。MecR1蛋白可被b-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合誘導(dǎo)而活化，從而解除MecI蛋白對mecA的阻遏作用，啟動合成更多的PBP2a，產(chǎn)生耐藥。mecI基因缺失、突變或失活后，mecA基因的轉(zhuǎn)錄及PBP2a的產(chǎn)量將成倍增加，對甲氧西林表現(xiàn)為高度耐藥。

研究發(fā)現(xiàn)，mec基因序列的核心還包含至少一類整合子（IS431 /IS257)。IS431能捕獲其他耐藥決定因子，整合到mec片段中，如可作為轉(zhuǎn)座子Tn554（編碼大觀霉素和紅霉素耐藥性)整合位點。因此，mec整合子在MRSA的進化和多重耐藥的發(fā)展中具有重要作用。

mecA基因來源尚不清楚，可能是pbp基因和bla基因在一種未知微生物中進行基因重組的產(chǎn)物，也可能是從耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌通過水平傳播獲得的。

耐藥輔助基因  除了mecA基因的調(diào)節(jié)系統(tǒng)外，金黃色葡萄球菌染色體上一些輔助基因fem也參與肽聚糖合成代謝（圖5-11，圖5-12)，共同負責(zé)甲氧西林耐藥性的最適表達。到目前為止，已分離出10多種fem基因的新家族，其中femA是高度保守的看家基因，幾乎存在所有的金葡菌中，為MRSA表達對β-內(nèi)酰胺類抗生素高水平耐藥性所必需的。femA、femB或femX基因滅活后，可使β-內(nèi)酰胺類耐藥株轉(zhuǎn)變成敏感株，因此，F(xiàn)emA、FemB和FemX有可能成為抗菌藥物的新的潛在的作用靶位。

圖5-12  fem基因產(chǎn)物作用的部位

（FemA：負責(zé)將第2、3個甘氨酸連接到五肽交聯(lián)橋之中；FemB：負責(zé)將第4、5個甘氨酸連接到五肽交聯(lián)橋之中；FemC：負責(zé)異谷氨酰胺的氨�；�作用；FemF：負責(zé)L-賴氨酸與UDP-N-乙酰胞壁酰二肽鏈之間的連接；FemD：負責(zé)將D-丙氨酰-D-丙氨酸加入到N-乙酰胞壁酰三肽鏈中；FemX：可能涉及第1個甘氨酸的連接)

（五)耐萬古霉素腸球菌（VRE)

VRE至少有VanA、VanB、VanC、VanD4種表型（表5-6)，其中VanA型VRE已在全球范圍內(nèi)蔓延。

表5-6  耐萬古霉素腸球菌耐藥情況

VanA型萬古霉素耐藥基因位于接合性R質(zhì)粒攜帶的轉(zhuǎn)座子Tn1546上。該轉(zhuǎn)座子大小為10 851bp，包含9個基因，分為4個功能區(qū)（圖5-13)：①轉(zhuǎn)座基因：開放讀碼框ORF1和ORF2，分別編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶；②耐藥調(diào)節(jié)基因：vanR和vanS；③耐藥結(jié)構(gòu)基因：vanH、vanA和vanX；④輔助蛋白基因：vanY和vanZ。

圖5-13  轉(zhuǎn)座子Tn1546上糖肽類抗生素耐藥基因及其編碼產(chǎn)物

IR_L和IR_R：反向重復(fù)序列

VanS為組胺酸蛋白激酶，可作為一個感受器，檢測環(huán)境中萬古霉素的存在，特別是萬古霉素對細胞壁合成的早期影響，然后向反應(yīng)調(diào)節(jié)器VanR傳遞信號�；罨�的VanR的DNA結(jié)合域（DNAbinding domain)與耐藥基因VanH的啟動子調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，從而激活耐藥結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄活性，大量表達與耐藥性有關(guān)的蛋白質(zhì)（VanH、VanA、VanX)。

VanH具有脫氫酶活性，可將丙酮酸還原成D-乳酸（D-Lac)，為VanA提供底物。VanA具有連接酶活性，催化由D-Lac與丙氨酸合成縮肽：D-Ala-D-Lac。細菌的加合酶能利用該縮肽與UDP-N-乙酰胞壁酰-三肽連接成相應(yīng)的UDP-乙酰胞壁酰-五肽側(cè)鏈，后者在轉(zhuǎn)肽酶作用下與鄰近五肽交聯(lián)，形成肽聚糖（圖5-2)。

VanX是二肽酶，不能水解D-Ala-D-Lac，但可水解D-Ala-D-Ala，減少用于合成正常前體五肽的D-Ala-D-Ala數(shù)量。如果一些D-Ala-D-Ala避開了VanX水解，結(jié)合到前體三肽上，VanY則作為羧肽酶水解前體五肽末端的殘基D-Ala，形成一個前體四肽，使萬古霉素不能與之結(jié)合。VanZ功能不清，并非萬古霉素耐藥性產(chǎn)生所必需，可能與替考拉寧耐藥性有關(guān)。

萬古霉素的作用靶位是N-乙酰胞壁酰五肽側(cè)鏈末端的D-Ala-D-Ala（圖5-2)，二者結(jié)合后可抑制轉(zhuǎn)肽酶和羧肽酶的作用，阻斷四（五)肽側(cè)鏈的形成或側(cè)鏈交聯(lián)，從而阻止細胞壁的合成，導(dǎo)致細菌死亡（圖5-2)。在萬古霉素耐藥菌株中，合成的D-Ala-D-Lac（或D-Ala-D-Hbut)代替D-Ala-D-Ala，用于肽聚糖合成。由于D-Ala-D-Lac酯鍵中的氧取代了D-Ala-D-Ala酯鍵中的NH基，破壞了萬古霉素與靶位之間的氫鍵，對藥物的親和力下降至1/1000以下，從而導(dǎo)致萬古霉素不能阻斷側(cè)鏈交聯(lián)，細菌得以生存。

Tn1546以轉(zhuǎn)座方式整合到可自行移動的質(zhì)粒上，后者以接合方式在不同腸球菌臨床分離株中頻繁地轉(zhuǎn)移，引起萬古霉素耐藥基因擴散。近期發(fā)現(xiàn)，由Tn1546和插入序列IS1251組成的轉(zhuǎn)座子Tn5482能將VanA型耐藥基因從腸球菌轉(zhuǎn)移到不同種屬的細菌，如金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌。

對于大多數(shù)萬古霉素非依賴型VRE，僅僅只有在萬古霉素存在時，才會誘導(dǎo)合成相關(guān)的脫氫酶（VanH)和連接酶（VanA)，以產(chǎn)生D-Ala-D-Lac取代D-Ala-D-Ala。萬古霉素依賴型VRE（VDE)菌株生長時，需要萬古霉素存在，最可能的解釋是，VDE菌株關(guān)閉了正常的D-Ala-D-Ala的合成途徑，即缺乏D-Ala-D-Ala連接酶，或被VanX作用所水解。只要萬古霉素存在（如患者接受萬古霉素治療時)，D-Ala-D-Ala不為VRE細胞壁合成所必需，而是誘導(dǎo)形成一個替代的二肽樣結(jié)構(gòu)，參與肽聚糖合成，VRE得以生長繁殖。一旦萬古霉素去掉，VDE菌株中D-Ala-D-Lac不再合成，沒有D-Ala-D-Lac和D-Ala-D-Ala，細菌則不能繼續(xù)生長繁殖。

第六節(jié)  抗生素應(yīng)用選擇壓力與耐藥性的產(chǎn)生

耐藥菌株出現(xiàn)和擴散的因素繁多，但起關(guān)鍵作用的是：①耐藥基因發(fā)生突變使耐藥譜增大；②細菌間遺傳物質(zhì)交換，將耐藥基因轉(zhuǎn)移到新宿主；③醫(yī)院及社區(qū)抗生素的廣泛應(yīng)用，為耐藥菌產(chǎn)生和長期存在于體內(nèi)，或更為廣泛地擴散，以及引起疾病提供了重要的選擇壓力（selective pressure)。前兩個為細菌本身生物學(xué)特性的因素，是耐藥性產(chǎn)生的客觀依據(jù)，后一個是人為因素，是抗生素耐藥性迅速傳播的主要推動力。此外，還與感染控制措施應(yīng)用不當(dāng)，各種先進的侵襲性診治手段的廣泛應(yīng)用，以及免疫忍容性宿主(immuno-compromised host)增多等因素有關(guān)。

一、抗生素的誘導(dǎo)作用

近年研究表明，抗生素能誘導(dǎo)某些細菌耐藥基因的表達。

AmpC β-內(nèi)酰胺酶基因表達的誘導(dǎo)  AmpC β-內(nèi)酰胺酶具有很強的可誘導(dǎo)性。通常情況下，AmpC酶不表達或低水平表達，但在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在時，該酶產(chǎn)量顯著上升，如陰溝腸桿菌AmpC酶活性比誘導(dǎo)前提高100倍左右，甚至1000倍，達到完全去抑制型水平。通常在強誘導(dǎo)劑（特別是亞胺培南、頭孢孟多、頭孢西丁)誘導(dǎo)后，AmpC酶的活性可以滅活第一、二、三代頭孢菌素和單環(huán)內(nèi)酰胺類。

目前對革蘭陰性菌染色體編碼的誘導(dǎo)性AmpC酶的調(diào)控機制已基本闡明（圖5-14)。研究發(fā)現(xiàn)，AmpC酶的表達受amp復(fù)合操縱子調(diào)控，amp操縱子由4個不連鎖的基因ampC、ampR、ampD和ampG組成。ampC是結(jié)構(gòu)基因，編碼AmpC酶。ampR編碼誘導(dǎo)性反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（AmpR)。ampD編碼N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸酰胺酶（AmpD)，ampG編碼膜結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白（AmpG)，參與肽聚糖的合成。

圖5-14  AmpC的表達調(diào)控

位于細胞膜上的AmpG將正常代謝中細胞壁降解物（UDP-N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽)從周漿間隙轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，胞內(nèi)AmpD能水解細胞壁降解物（包括UDP-N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽，UDP-N-乙酰胞壁酰三肽)，釋放糖和小肽（L-Ala-D-Glu-DAP)，重新參與細胞壁合成的再循環(huán)。

當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素不存在時，AmpR為負調(diào)控因子（抑制子)，主要與一個抑制性配體-細胞壁前體UDP-N-乙酰胞壁酰五肽結(jié)合，以失活狀態(tài)結(jié)合在ampR-ampC之間區(qū)域，使ampC基因的轉(zhuǎn)錄處于受抑制狀態(tài)。但當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素存在時，細胞壁合成受阻，細胞壁降解產(chǎn)物UDP-N-乙酰胞壁酰三肽水平升高，UDP-N-乙酰胞壁酰五肽水平降低，N-乙酰胞壁酰三肽與抑制性配體競爭AmpR上的結(jié)合位點，從而解除抑制性配體的抑制作用。此時，AmpR為正調(diào)控因子（激活子)。AmpR激活ampC基因的轉(zhuǎn)錄，過量表達AmpC酶。

AmpD維持UDP-N-乙酰胞壁酰五肽與UDP-N-乙酰胞壁酰三肽在數(shù)量上的平衡，控制著ampC轉(zhuǎn)錄信號的強弱。AmpD基因突變產(chǎn)生有功能缺陷的AmpD時，AmpR即以激活子狀態(tài)發(fā)揮作用，引起大量的β-內(nèi)酰胺酶表達，成為穩(wěn)定去抑制表型。在使用某些第三代頭孢菌素期間，可誘導(dǎo)選擇出穩(wěn)定的去抑制的突變株，使AmpC酶高水平表達。

金黃色葡萄球菌mecA基因表達的誘導(dǎo)  臨床實驗室常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)，一些攜帶mecA基因的金黃色葡萄球菌仍然顯示對甲氧西林敏感，被稱為“準(zhǔn)MRSA”，這是由于其mecA基因被強烈抑制所致。當(dāng)它們接觸β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)劑后，即迅速激活MecR1，產(chǎn)生PBP2a，對甲氧西林轉(zhuǎn)呈耐藥。

此外，長期使用抗生素可誘導(dǎo)細菌耐藥水平提高，增加耐藥基因如R質(zhì)粒在細菌之間轉(zhuǎn)移的頻率。

二、抗生素的篩選作用

通過自發(fā)突變或“耐藥基因”轉(zhuǎn)移而成為耐藥性的菌株，具備了適應(yīng)外界環(huán)境改變的能力，但是，耐藥菌株在菌群中僅占極少部分，并且需消耗能量保持耐藥基因（如R質(zhì)粒)或泵出抗菌藥物，外膜通透性降低雖能阻止抗生素進入，但同時亦影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，因此，在自然環(huán)境下，耐藥菌難以與占有壓倒優(yōu)勢的敏感菌競爭，其生長規(guī)模必然受到正常菌群的拮抗。然而，抗生素的廣泛應(yīng)用提供了對耐藥突變株的選擇環(huán)境。

研究發(fā)現(xiàn)，許多很少服用抗生素的病人剛住院時，其腸道及其他部位分離的菌株大部分是敏感菌株。當(dāng)給病人長期使用抗生素，尤其是廣譜抗生素時，敏感菌株（包括拮抗耐藥菌的部分正常菌群)將迅速被抑制或“淘汰”，使得病人對醫(yī)院流行的耐藥菌株變得更加易感，耐藥性細菌（主要來自醫(yī)護人員或住院已久的病人，或自身耐藥突變株)乘機侵入并大量繁殖，成為新的優(yōu)勢菌，最終取代敏感菌株的地位�？梢�，抗生素在耐藥菌產(chǎn)生過程中起到篩選作用。例如，在日本，1993～1994年淋球菌對青霉素耐藥率為20.5%，對環(huán)丙沙星耐藥率為6.6%。由于第三代頭孢菌素和環(huán)丙沙星取代青霉素，成為治療淋病一線藥，到1997～1998年，青霉素耐藥率下降為12.7%，而環(huán)丙沙星則上升到24.4%。

現(xiàn)今大多數(shù)質(zhì)粒與前青霉素時代菌株中的質(zhì)粒唯一不同之處是，攜帶了耐藥基因，提示耐藥菌大多產(chǎn)生于抗生素發(fā)現(xiàn)之后。在抗生素使用不受限制的國家，細菌（特別是腸桿菌科)攜帶R質(zhì)粒的頻率通常較高。

G^－桿菌R質(zhì)粒的產(chǎn)生和擴散伴隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素的發(fā)展和應(yīng)用。20世紀(jì)50年代，青霉素耐藥腸桿菌科菌迅速增長，大多攜帶編碼青霉素酶的質(zhì)粒。耐酶青霉素和頭孢菌素問世后，隨之出現(xiàn)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株，尤其是超廣譜頭孢菌素的泛用和濫用，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶基因發(fā)生點突變，編碼ESBL的質(zhì)粒迅速出現(xiàn)和傳播。目前，ESBL的種類和數(shù)量正以驚人的速度在發(fā)展。

近年來，在臨床廣泛應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類抗生素/克拉維酸和頭霉素的選擇壓力下，AmpCβ-內(nèi)酰胺酶由原來局限于染色體編碼逐漸向質(zhì)粒編碼轉(zhuǎn)移，每年發(fā)現(xiàn)1～2個新質(zhì)粒，這大大提高了AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的水平傳播能力。可以預(yù)見，在不遠的將來，各種編碼AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的質(zhì)粒將在全球范圍內(nèi)流行。

抗生素的篩選作用從總體上導(dǎo)致耐藥基因庫擴充，病原菌獲得耐藥性機會增加，一些耐藥菌本身也可成為條件致病菌。例如，萬古霉素投入臨床使用30多年后，一直沒有出現(xiàn)明顯耐藥現(xiàn)象。隨著MRSA、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌和艱難梭菌感染暴發(fā)流行，萬古霉素用量急劇上升，20世紀(jì)80年代出現(xiàn)VRE，并迅速波及全球，糞腸球菌已成為萬古霉素耐藥性貯存宿主，進而可能傳播到金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌。又如，腸道正常菌群糞腸球菌對頭孢菌素呈現(xiàn)固有耐藥，頭孢菌素的廣泛應(yīng)用促進糞腸球菌大量繁殖，已成為醫(yī)院感染重要病原菌。

三、抗生素在臨床和臨床之外的應(yīng)用

（一)在臨床方面的應(yīng)用

細菌耐藥性的產(chǎn)生與變遷與臨床上抗生素廣泛或過度應(yīng)用有絕對關(guān)系。醫(yī)院環(huán)境中抗生素選擇壓力的長期存在，一方面篩選出毒力弱，但對許多抗生素呈固有耐藥的條件致病菌；另一方面篩選出毒力強，原來對抗生素敏感轉(zhuǎn)呈耐藥的致病菌。

醫(yī)院是抗生素使用集中的地方，院內(nèi)的細菌耐藥率明顯高于社區(qū)，同一種細菌，院內(nèi)分離株耐藥性較強和較廣譜。對某一特定藥物耐藥率的波動與醫(yī)院抗生素使用規(guī)定的變化有關(guān)。大醫(yī)院在高價位抗生素上用藥比例和數(shù)量較多，院內(nèi)多重耐藥菌比例和量也較大。

在ICU，耐藥菌檢出率遠高于其他病房，常見的MRSA、凝固酶陰性葡萄球菌、VRE、革蘭陰性桿菌等均呈多重耐藥性。產(chǎn)ESBL菌在ICU、血液病科、腫瘤病房、燒傷病房、新生兒房分離率較高，這與抗菌藥物使用頻率密切相關(guān)。一些原本無害的不動桿菌和黃單胞菌屬數(shù)年前幾乎未聽說過，因抗生素的濫用出現(xiàn)多重耐藥性，已成為住院患者致命的血源性感染的重要病原菌。以上反映了ICU抗生素選擇壓力的水平，已形成抗生素大量使用與耐藥菌株頑強遞增的惡性循環(huán)。

那么，人類是如何陷入細菌耐藥性的困境呢？調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在絕大多數(shù)病歷，在病原菌及其藥敏結(jié)果出來前已開始憑經(jīng)驗選擇用藥，待藥敏報告再作調(diào)整，而有的可能始終無藥敏結(jié)果，從某種意義上講，這是細菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。一些醫(yī)生不顧抗菌藥物使用限制的有關(guān)規(guī)定，繼續(xù)開出過量或不適當(dāng)?shù)目咕�藥物，例如�?/p>

（1)用于無細菌感染并發(fā)征的病毒感染。全球抗生素處方中用于呼吸系統(tǒng)感染治療占3/4。實際上，90%以上的感冒和呼吸道感染是由各類病毒而非細菌引起，抗生素對病毒性感染不起作用，反而會因過度使用引起菌群失調(diào)，加速細菌抗藥性的產(chǎn)生和擴散，使原本容易治愈的病癥變得難以治療。

（2)選用對病原菌無效或療效不強的藥物。病原體產(chǎn)生耐藥后繼續(xù)用以往藥物，產(chǎn)生耐藥菌二重感染時未改用其他藥物。有的人為了追求經(jīng)濟效益，總喜歡使用昂貴的新型廣譜抗生素，或多種抗生素聯(lián)用。對高危重病患者，越來越依賴最新的更廣譜的抗菌藥物。

（3)劑量不足或過大，過早停藥或感染已控制多日而不及時停藥，尤其是外科手術(shù)無感染指征的預(yù)防性使用抗生素，術(shù)前應(yīng)用過早，術(shù)后停藥過晚。目前一般采用術(shù)前2～3d、術(shù)后5～7d的給藥方法，但現(xiàn)在認為這種方法不很恰當(dāng)，需用抗生素加以覆蓋的感染危險期一般不超過24～48h。

在美國超過1/2的住院病人和1/3門診病人屬于不該使用抗生素或使用不當(dāng)。在很多發(fā)展中國家，許多抗生素不需處方隨便可以買到，無指征濫用現(xiàn)象嚴(yán)重……。據(jù)報道，我國抗生素的合理使用率只有40%，例如，某部隊大醫(yī)院對7800份住院病例調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨床無感染及預(yù)防指征使用第三代頭孢菌素占23.5%，治療首選第三代頭孢菌素占64%，依據(jù)病原學(xué)檢查結(jié)果治療的病例只占12.5%，參考藥敏結(jié)果選藥者僅占7.8%，顯然存在不合理用藥現(xiàn)象。

（二)在獸醫(yī)與畜牧業(yè)方面的應(yīng)用

耐藥菌株產(chǎn)生和擴散速度不僅僅是臨床上廣泛使用抗菌藥物的結(jié)果，還與獸醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖泛用抗生素有密切關(guān)系。例如，美國生產(chǎn)的40%以上抗生素用于畜牧業(yè)，其中80%混入飼料作為生長促進劑（growth promoter)，因為進食含亞治療劑量抗生素飼料的動物能增重4%～5%。1992～1996年澳大利亞每年進口近600公斤萬古霉素用于臨床，而用于畜牧業(yè)的另一糖肽類抗生素阿伏帕星（avoparcin)超過6000公斤。畜牧業(yè)長期大量非治療性應(yīng)用抗生素必然導(dǎo)致耐藥性細菌的出現(xiàn)，主要是動物源性病原菌，如引起腹瀉的沙門菌和空腸彎曲菌，以及人畜共患病原菌，如大腸埃希菌和腸球菌。

由于人和動物微生態(tài)系關(guān)系密切，抗生素耐藥性容易突破物種界線，即通過進食和直接與感染動物（或動物糞便)接觸，動物體內(nèi)耐藥菌進入人體消化道，然后將耐藥基因轉(zhuǎn)移到人體致病菌中，導(dǎo)致耐藥基因擴散，抗生素耐藥性細菌庫不斷增大。例如，阿伏帕星是非人用抗生素，但由于交叉耐藥，動物飼料中添加阿伏帕星明顯促進耐萬古霉素腸球菌的出現(xiàn)。萬古霉素耐藥基因vanA整合在接合性質(zhì)粒上，可在動物腸球菌菌株之間擴散，并傳遞給人體腸球菌。可見，畜牧業(yè)應(yīng)用抗生素是某些病原菌耐藥性發(fā)展的重要推動力。

四、耐藥菌的擴散

雖然抗菌藥物使用和濫用是耐藥性迅速產(chǎn)生的一個重要因素，但醫(yī)務(wù)人員感染控制基本技術(shù)的應(yīng)用不當(dāng)是造成耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)擴散的主要原因。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，醫(yī)護人員的手是耐藥菌的主要傳播途徑。例如，醫(yī)務(wù)人員與病人大量接觸前后忽視洗手；未按規(guī)定戴手套；脫去手套后沒有充分洗手。在擁擠不堪、嚴(yán)重缺員，以及抵抗力極差的重癥患者集中的單位，耐藥菌經(jīng)醫(yī)務(wù)人員污染的手為媒介的人─人傳播的危險性最大。這些患者呼吸道和消化道正常（敏感)菌群能迅速被醫(yī)院流行的耐藥菌株所取代，通常數(shù)天之內(nèi)，每毫升呼吸道分泌物或每毫克糞便中耐藥菌的數(shù)量達到數(shù)萬億個。如操作不嚴(yán)格，機械通風(fēng)或患者大小便失禁將大大增加醫(yī)務(wù)人員污染手的可能性。

最新研究表明，如果不用含抗菌藥物的肥皂洗手，耐藥的G^＋球菌和G^－桿菌仍然存活，如萬古霉素耐藥腸球菌（VRE)在手上能存活約30min。

分子流行病學(xué)研究表明，耐藥菌可以在同一病房或醫(yī)院內(nèi)、醫(yī)院之間、一個地區(qū)引起暴發(fā)流行，有時甚至跨越國界擴散，其中最突出的是，青霉素耐藥肺炎鏈球菌MMSp23F血清型首先在西班牙報道，之后傳播到美國、南非、歐洲和香港等地。美國曾發(fā)生多次VRE暴發(fā)，在同一醫(yī)院不同患者體內(nèi)常常鑒定出相同的VRE菌株。在美國洛杉磯從5所不同醫(yī)院分離的VanB型VRE，91%菌株為同一克隆，不僅在患者和醫(yī)務(wù)人員體內(nèi)檢出，而且存在于許多醫(yī)療器械和病人所用物品上，提示存在醫(yī)源性交叉感染。

全球化貿(mào)易大幅度增加了人員流動，進而加速病原微生物包括耐藥菌株的傳播和蔓延。

第七節(jié)  細菌耐藥性的控制策略

如果說抗菌藥物的出現(xiàn)是人類第一次征服細菌，細菌耐藥性則是對人類智慧的又一次嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

一、強細菌耐藥性監(jiān)控

這是了解細菌耐藥性趨勢、正確制定治療指南和恰當(dāng)評定措施有效性的關(guān)鍵因素。應(yīng)加強國際間交流與合作，構(gòu)建細菌耐藥性全球監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)現(xiàn)有的耐藥性監(jiān)控網(wǎng)點，大力培訓(xùn)監(jiān)測人員，以保證結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化、有效性、可靠性，為耐藥細菌流行的監(jiān)控提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，共同制定對策，遏制耐藥細菌的發(fā)生和擴散。

臨床微生物學(xué)實驗室應(yīng)利用計算機軟件，對臨床各種標(biāo)本的病原菌分離率和耐藥譜，以及抗菌藥物應(yīng)用結(jié)果進行統(tǒng)計分析，定期報告給醫(yī)院感染科，再反饋給臨床各科室，以便讓臨床醫(yī)生及時掌握所在醫(yī)院病原菌及其耐藥性變化的最新動態(tài)，有計劃地交替使用高敏感性的抗生素。

目前對耐藥菌的監(jiān)測重點是MRSA、VRE、PRSP和產(chǎn)ESBL革蘭陰性桿菌。應(yīng)對各科室治療室、換藥室和ICU的空氣和物品，以及醫(yī)護人員的手，尤其是癌癥患者，ICU監(jiān)護患者，器官移植患者和燒傷患者等易感人群進行耐藥菌監(jiān)測。

二、少選擇壓力，逆轉(zhuǎn)耐藥性

早在1960年就有學(xué)者指出，應(yīng)通過減少抗生素應(yīng)用選擇壓力，讓那些產(chǎn)生耐藥突變的微生物群體失去與野生型敏感菌的競爭優(yōu)勢而逐漸減少或消失，從而阻止耐藥性的發(fā)生與蔓延。近年來，根據(jù)耐藥性變遷特點，通過限制某些抗生素的應(yīng)用或改變抗生素的應(yīng)用種類，有計劃地定期或劃區(qū)停用某種抗生素，或循環(huán)使用抗生素，對恢復(fù)細菌對抗生素的敏感性和遏制細菌耐藥性已顯示出良好的前景。

在芬蘭，1990年從咽部和膿汁中分離的紅霉素耐藥A族鏈球菌為13.2%，1993年上升為19%。隨著紅霉素和其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的用量減少，到1998年該菌紅霉素耐藥檢出率下降了50%。又如，1996年，為對付VRE和艱難梭菌假膜性腸炎暴發(fā)流行，美國某醫(yī)院減少了第三代頭孢菌素用量，改用氨芐西林/舒巴坦或哌拉西林/他唑巴坦，結(jié)果一年后患者糞便中VRE定植率從47%下降到15%，艱難梭菌感染率亦下降了50%。

可見，只要堅持正確引導(dǎo)合理使用抗生素，停止藥店無處方出售抗生素，限制抗生素的使用，鼓勵農(nóng)場主在食用動物中使用非人用和不會選擇交叉耐藥的抗生素，或用微生態(tài)制劑替代抗菌藥物，高耐藥率是完全可以逆轉(zhuǎn)的。

三、速準(zhǔn)確檢測耐藥性

在處理細菌感染時，速度極為重要。在病原菌及其藥敏鑒定結(jié)果出來之前（通常為48h)，病人已經(jīng)開始接受經(jīng)驗性治療，抗菌藥物的選擇是基于感染的臨床特征。當(dāng)疑為嚴(yán)重感染或醫(yī)院感染時，常采用廣譜抗生素治療，尤其是對ICU住院病人或急診室病人使用更為頻繁，這就難免不出現(xiàn)不合理用藥現(xiàn)象。因此，快速檢測病原菌及其耐藥性，將會大大減少誤用的抗生素處方率，幫助醫(yī)生選用針對性更強的抗生素，縮短療程，減輕細菌耐藥性產(chǎn)生和擴散的選擇壓力，延緩耐藥菌株的出現(xiàn)。

常規(guī)藥敏試驗（如平板擴散法、E試驗法)是以“菌”為中心，首先從臨床標(biāo)本中分離出病原菌，再作藥敏試驗，至少需要2d才能得到結(jié)果，對于生長緩慢和營養(yǎng)要求苛刻的細菌所需時間更長，對于耐藥株與敏感株混合感染難以保證結(jié)果的可靠性。因此，建立快速、準(zhǔn)確地檢測耐藥性的分子藥敏試驗法十分重要。

分子藥敏試驗是以耐藥性檢測代替敏感性檢測。通常先通過PCR擴增耐藥（突變)基因，擴增產(chǎn)物再通過以下方法檢測：瓊脂糖凝膠電泳、探針雜交、微板雜交-ELISA法、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP)、直接測序。例如，葡萄球菌對甲氧西林的耐藥機制是由于產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白，其編碼基因mecA的存在和甲氧西林耐藥性之間有很好的相關(guān)性，因此PCR檢測mecA基因可能成為甲氧西林耐藥性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。又如，幽門螺桿菌耐克拉霉素的分子機制是，23SrRNA基因2143和2144位點發(fā)生了A→G點突變，2143位點還存在A→C點突變，可采用PCR-微板雜交（圖10-6)或PCR-RFLP法直接檢測胃粘膜或胃液中幽門螺桿菌及其對克拉霉素的耐藥性。

近年發(fā)展的基因芯片技術(shù)在檢測耐藥基因上具有很大潛力，特別適合于檢測多個基因和/或多重突變引起的某種微生物的耐藥，如結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的耐藥和艾滋病病毒對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的耐藥。美國已研制出同時檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙氨丁醇3種藥物的耐藥性，檢出率分別達到75%、50%和70%，并能區(qū)分人型結(jié)核分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌。

與常規(guī)藥敏方法相比，分子藥敏試驗法具有特異性強、敏感度高、快速等優(yōu)點，能直接檢測臨床標(biāo)本中病原菌的耐藥性，尤其適于難以培養(yǎng)或培養(yǎng)時間長的病原菌，可減少細菌培養(yǎng)過程中耐藥性的擴散，應(yīng)在大多數(shù)臨床微生物學(xué)實驗室推廣。但是，目前尚需不斷完善與發(fā)展，特別是在確定細菌耐藥基因與耐藥性的關(guān)系上。

四、學(xué)合理用藥，防止耐藥菌株的產(chǎn)生

耐藥菌株非正常增加，往往伴隨著抗菌藥物的非正常使用。由于人類開發(fā)新型抗生素的速度已落后于細菌耐藥性的發(fā)展速度，因而細菌耐藥性不可能根除，只能對抗或延緩耐藥性的發(fā)生，為此，應(yīng)有組織、有計劃、有目的合理控制使用抗菌藥物，以延長抗菌藥物使用壽命。然而，這一最重要的防治措施尚未受到應(yīng)有的重視。應(yīng)加強對醫(yī)生進行合理使用抗生素教育，規(guī)范醫(yī)生處方，賦予藥師監(jiān)督處方的權(quán)利，讓病人和公眾了解細菌的耐藥現(xiàn)狀及其危害。合理用藥包括以下幾個方面：

嚴(yán)格掌握抗菌藥物應(yīng)用的適應(yīng)證  病毒性感染和發(fā)熱原因不明者，除并發(fā)細菌感染外，不宜輕易采用抗菌藥物。因為一旦用藥之后，使臨床表現(xiàn)不典型，難以確診，延誤正確治療。但對病情危重者，抗生素的使用可適當(dāng)放寬。盡量避免使用抗生素作預(yù)防性治療和皮膚、粘膜等局部用藥，以防誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生。例如，萬古霉素的應(yīng)用僅限于下列適應(yīng)征：由耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的革蘭陽性菌所致的嚴(yán)重感染；對β-內(nèi)酰胺類抗生素嚴(yán)重過敏患者；因抗生素應(yīng)用引起艱難梭菌假膜性腸炎，使用甲硝唑治療失敗患者；外科手術(shù)后感染和MRSA感染高�；颊�，可預(yù)防性采用亞劑量萬古霉素。

正確選擇抗菌藥物和配伍  在使用抗生素前，原則上除危重患者外應(yīng)先從患者體內(nèi)分離致病菌，并做細菌藥物敏感試驗，以便選擇敏感的抗生素治療，盡可能使用窄譜、價廉抗生素，保留廣譜、新型和價昂抗生素作備用。按病情階梯性選藥，不任意跨代用藥。病情危重者或培養(yǎng)失敗者或受各種條件限制不能培養(yǎng)者，可根據(jù)臨床經(jīng)驗和感染部位選用抗生素，但可靠性差。

聯(lián)合用藥可降低耐藥性突變頻率，從不同環(huán)節(jié)控制產(chǎn)生耐藥性，但必須有明確的指征，如：①病原菌未明或單一藥物不能控制的嚴(yán)重感染；②多種細菌引起的混合感染；③較長期用藥有可能產(chǎn)生耐藥者，如結(jié)核病往往同時使用利福平、異煙肼和吡嗪酰胺。但一種藥物可以控制的感染，不可任意采用多種藥物聯(lián)合�？捎谜�譜者就不用廣譜。

正確掌握劑量、療程和給藥方法  用藥量應(yīng)保證血液或感染組織達到有效抑菌或殺菌濃度，及時殺滅病原菌。避免劑量過大或療程過長而造成藥物浪費和加劇副作用；又要注意由于劑量不足而致病情遷延，轉(zhuǎn)為慢性、復(fù)發(fā)，誘導(dǎo)細菌耐藥性的產(chǎn)生。療程應(yīng)盡量縮短，及時停藥。

五、格執(zhí)行消毒隔離制度，防止耐藥菌的交叉感染

醫(yī)院應(yīng)建立一支感染控制隊伍，加強醫(yī)院感染控制措施，預(yù)防耐藥菌的暴發(fā)流行。醫(yī)務(wù)人員檢查病人時必須正確及時洗手，對與病人接觸較多的醫(yī)生、護士和護工，應(yīng)定期檢查帶菌情況；發(fā)現(xiàn)帶菌時應(yīng)暫時調(diào)離病房，以免傳播耐藥菌感染。

對耐藥菌感染的患者，尤其是VISA、VRE和MRSA定植或感染者，應(yīng)予隔離，主要措施包括：①VRE感染患者住單獨病房或與其他VRE感染者合住，教育患者防止交叉感染；②進入VRE感染患者病房戴上手套，離開時用含抗菌藥物的肥皂洗手；③當(dāng)需要與患者身體或病房物品接觸時，應(yīng)穿上隔離衣。

需要隔離保護的易感人群包括：①有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，如骨髓移植、糖尿病等；②曾接受多種抗生素（特別是第三代頭孢菌素或萬古霉素)治療；③ICU、腫瘤科和外科長期住院；④接受侵襲性診治；⑤與VISA、VRE和MRSA患者接觸者。

應(yīng)大力改善社區(qū)衛(wèi)生條件，通過減少細菌感染來阻止耐藥性從動物傳播到人類。

六、找新型抗菌藥物和新的抗感染方法

一種新的抗生素從發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用，通常需要6～7年。因此，尚難預(yù)料人類發(fā)明新的抗生素的速度能否跟上細菌產(chǎn)生耐藥性的速度。

改良現(xiàn)有抗生素  保留其原有細菌靶位的作用，但避免現(xiàn)有耐藥機制。例如，

1．發(fā)展耐酶抗生素或滅活酶抑制劑 針對細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機制，可考慮開發(fā)具有對酶的失活作用穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物，如碳青霉烯類（亞胺培南)、青霉烯類（呋羅培南fropenem)等，亦可篩選β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑，如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦和硼酸類化合物，與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，如阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦，可阻止對酶不太穩(wěn)定的抗生素被降解。大多數(shù)產(chǎn)ESBL細菌對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感，但上述β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對染色體介導(dǎo)的C組β-內(nèi)酰胺酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用很弱或無。近年已篩選出一些新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（如CL-186195、J-110441)，對金屬β-內(nèi)酰胺酶和C組β-內(nèi)酰胺酶顯示強力抑制作用。迄今為止，尚未開發(fā)出除β-內(nèi)酰胺酶抑制劑外的酶抑制劑。

對氨基糖苷類抗生素進行結(jié)構(gòu)改造，使之不被修飾酶滅活。例如，阿米卡星是在卡那霉素分子中引入保護基團而成，可避免修飾酶鈍化，地貝卡星則是通過剔除卡那霉素中易被修飾酶修飾的基團而成。

2．抑制外排系統(tǒng) 細菌對四環(huán)素耐藥主要是通過外排系統(tǒng)不斷將進入菌體內(nèi)藥物排出體外。可設(shè)計與排出泵親和力更強的四環(huán)素結(jié)構(gòu)類似物，阻止排出泵有效地排出四環(huán)素；或?qū)λ沫h(huán)素加以改造，抑制泵出蛋白的活性，或降低與外排泵親和力。如經(jīng)化學(xué)改造的新一類四環(huán)素甘氨環(huán)素（glycylcycline)具有廣譜的抗菌活性。

3．增加與靶位親和力 萬古霉素的分子結(jié)構(gòu)加上一個疏水性環(huán)狀支鏈后，對萬古霉素敏感的革蘭陽性菌和VRE顯示很好的活性，如LY333328的藥效高出萬古霉素1000多倍。針對MRSA，可研制與PBP2a有強親和力的β-內(nèi)酰胺類抗生素（如新型碳青霉烯類L-695256和SM-17466)或fem基因抑制劑。三環(huán)類β-內(nèi)酰胺類抗生素sanfetrinem對PRSP的PBP1a和PBP2b有很強的親和力，對許多常見的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。

尋找細菌內(nèi)抗菌作用的新靶子  修補現(xiàn)有抗生素只是權(quán)宜之計，并不能贏得太多時間來對付聰明的細菌，因為這類藥物從基本結(jié)構(gòu)上沒有避開現(xiàn)有的耐藥機制，細菌稍加突變，能很快形成新的耐藥機制，因而針對耐藥菌設(shè)計全新作用機制的抗菌藥物迫在眉睫。

要以病原菌為目標(biāo)，利用細菌基因組學(xué)、生物信息學(xué)和體內(nèi)基因表達技術(shù)，確定感染過程中被特異誘導(dǎo)的重要疾病基因及其功能，闡明細菌的耐藥機制及其與宿主之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)哪些對病原菌生存必不可少，感染過程又常常優(yōu)先表達的因子，如病原菌在活體內(nèi)感染時才表達的基因和基因產(chǎn)物（如毒力)，而不是體外培養(yǎng)皿環(huán)境中生長時所表達的產(chǎn)物。有效的靶位可能是基因或基因產(chǎn)物（如涉及細胞分裂、蛋白質(zhì)合成、代謝物轉(zhuǎn)運、毒力，以及宿主細胞凋亡等)。選擇這些因子作為藥物篩選的新靶標(biāo)，采用超高通量藥物篩選系統(tǒng)，發(fā)展新的治療藥物（或治療性疫苗)，可以減少耐藥基因選擇和擴散的機會。不過，對這些高度特異靶位的藥物比傳統(tǒng)的抗生素具有更窄的作用譜，要求有相應(yīng)的快速診斷系統(tǒng)與之相匹配。

開發(fā)抗菌中藥復(fù)方和天然抗微生物肽  研究表明，中藥復(fù)方成份復(fù)雜，作用機制和環(huán)節(jié)多，既有直接的抗菌作用，又有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用，不易產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)加強對中藥復(fù)方抗菌的研究與開發(fā)。來源于動物的抗微生物肽正在開發(fā)之中，包括protegrin、爪蟾抗菌肽（magainin)、防御素（defensin)、鯊胺（qualamine)等。此外，將抗藥性好的抗生素與最有效的細胞因子合二為一，具有抗菌和調(diào)節(jié)抗感染免疫的雙重作用。

引入“以菌制菌”的微生態(tài)調(diào)整療法  抗生素耐藥性的發(fā)展，忍容性宿主中機會性感染的增加，新的致病菌的出現(xiàn)，導(dǎo)致臨床上大量使用抗生素，進而加劇耐藥菌株的出現(xiàn)和擴散，需要不斷換用新的抗生素。因此，需要尋找新的策略來防治感染性疾病。源于自然、回歸自然的微生態(tài)制劑（probiotic)能通過生物拮抗、營養(yǎng)爭奪、占位性保護等多種機制拮抗某些致病菌，從而調(diào)整微生態(tài)平衡，提高宿主防御功能。病原菌通過基因突變產(chǎn)生耐藥性的危險性減少。微生態(tài)制劑將為感染性疾病的治療提供新途徑。

在某些局部感染時可用噬菌體作為一種輔助治療，如應(yīng)用銅綠假單胞菌噬菌體治療創(chuàng)口感染�？赏ㄟ^基因工程技術(shù)改造噬菌體，使其進入人體后能攻擊多種類的病原菌，突破噬菌體對其宿主裂解的專一性。

發(fā)展疫苗  這是解決難以治療的耐藥性細菌的最好辦法。疫苗接種可降低細菌感染發(fā)生率，從而減少抗生素用量，延緩耐藥性的出現(xiàn)，應(yīng)大力發(fā)展較難治療的常見耐藥菌的有效疫苗。

展望21世紀(jì)，人類將有可能有效地控制耐藥性細菌的感染。

（龍北國  第一軍醫(yī)大學(xué))