免疫細胞化學在細菌學中主要用于菌種鑒定和抗原結構的研究。細胞都各自有其特異性抗原,應用特異性抗體的熒光素或酶標記物,可以鑒定任何一種細菌。已經成功地用于鑒定幾乎所有致病菌的純培養(yǎng)。尤其是應用免疫熒光技術具有較其他血清學方法簡便、快速和敏感等優(yōu)點,并能直接進行細菌形態(tài)觀察。可用于鑒定的材料也比較多樣,如培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物,外環(huán)境中采集材料(土壤、水、雜物等)。由于此法對某些傳染病原能較常規(guī)方法作出更快速的診斷,因而具有特殊意義。
免疫細胞化學方法用于研究細菌抗原結構和形態(tài)學觀察,由于單克隆抗體的應用,比其他方法更為有效。
圖16-1 免疫熒光在病原細菌診斷程序中的應用時機
從患者咽部粘膜用棉拭子取標本,作涂片用甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色,能夠很快作出診斷。對于痢疾桿菌、霍亂孤菌、布氏桿菌、炭疽桿菌和腦膜炎雙球菌、肺炎雙球菌等的實驗診斷均有較好的效果(如表16-1)。
利用間接免疫熒光或酶標記抗體法,檢測患者血清中的抗體更有價值,廣泛用于臨床診斷和流行病學研究。
表16-1 免疫熒光細胞化學方法在細菌診斷中的應用評價
菌種 | 疾病 | 標本 | 方法 | 敏感性 | 特異性 | 意義 |
甲組鏈球菌 | 急性咽峽炎 猩紅熱 | 咽部培養(yǎng)物 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
急性風濕熱 | ||||||
乙組鏈球菌 | 新生兒敗血癥 | 陰道拭子 | DIF | 高 | 中 | 快速 |
腦膜炎 | 臨床標本 | 鑒定 | ||||
牛型乳腺炎 | 培養(yǎng)物 | |||||
致病性大腸桿菌 | 嬰兒腹瀉 | 大便 | DIF | 高 | 中 | 過篩 |
桿菌 | ||||||
傷寒沙門氏菌 | 腸傷寒 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
沙門氏菌 | 腸炎 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
(大多數(shù)血清型) | 腸熱腦膜炎 | 食品 | 過篩 | |||
環(huán)境標本 | ||||||
培養(yǎng)物 | ||||||
志賀氏菌屬 | ||||||
宋內氏菌 | 菌痢 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
福氏菌 | 菌痢 | 大便 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
百日咳桿菌 | 百日咳 | 鼻咽涂片 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
流感嗜血桿菌 | 細菌性腦膜炎 | 腦脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
肺炎球菌 | 細菌性腦膜炎 | 腦脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
腦膜炎球菌 | 細菌性腦膜炎 | 腦脊髓 | DIF | 高 | 高 | 快診 |
出血點 | (差) | |||||
軍團菌病 | 小葉肺炎 | 痰,肺滲出物 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
肺組織切片 | IIF | 快診 | ||||
李氏菌 | 李氏單核細胞 | 體液涂片 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
增多癥 | 組織切片 | |||||
布氏桿菌 | 布氏癥 | 胎盤 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
(牛、羊、豬型) | (人、畜) | 病理組織培養(yǎng)物 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
結核桿菌 | 結核病 | 痰及其消化液 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
胎兒孤菌 | 孤菌病 | 子宮陰道粘液 | DIF | 高 | 中 | 診斷 |
類丹毒菌 | 動物感染 | 血液、組織、培養(yǎng)物 | DIF | 較高 | 高 | 診斷 |
放線菌 | 放線菌病 | 扁桃腺病理排泄物 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
鉤端螺旋體 | 鉤體病 | 尿沉渣,新鮮組織刮片或切片培養(yǎng)物 | DIF | 中 | 高 | 診斷 |
奈瑟氏淋球菌 | 淋病 | 結膜、皮膚破損,關節(jié) 液 | DIF | 較高 | 中 | 過篩 |
綠膿桿菌 | 肺炎 | 病理組織 | DIF | 較高 | 中 | 診斷 |
類鼻疽桿菌 | 類鼻疽 | 排泄物 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
病理組織 | DIF | 中 | 高 | 診斷 | ||
馬疽桿菌 | 鼻疽 | 排泄物 | DIF | 高 | 高 | 早診 |
病理組織 | ||||||
脆弱類桿菌 | 敗血癥 | 血及其他有關臨床標本 | DIF | 高 | 較高 | 診斷 |
黑色素源標菌 | 牙周病物 | 病變部位分泌物 | DIF | 高 | 高 | 輔診 |
臟器膿腫 | ||||||
梭狀芽胞桿 | 肉毒中毒 | 食物 | DIF | |||
菌屬 | 動物黑腿病 | |||||
變部組織 | ||||||
羊炭疽 | 大便等 | DIF | 高 | 較高 | 輔診或診斷 | |
氣性壞疽 | ||||||
破傷風 | ||||||
結腸炎等 | ||||||
沙眼衣原體 | 沙眼 | 結膜刮片 | DIF | 高 | 高 | 診斷 |
(引自,黃策:免疫熒光和熒光免疫。1983)
(一)試劑制備
用抗甲組溶血性鏈球菌的抗體,以FITC標記,制成熒光抗體,再用C和G鏈球菌充分吸收;或用抗I型鏈球菌M蛋白成分的血清,標記后吸收,都有可靠的特異性。
(二)檢查方法
(1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜,取標本。
(2)將拭子浸入1ml肉湯小試管內,37℃培養(yǎng)2~3h。
(3)取出棉拭了作分離培養(yǎng),常規(guī)鑒定。將肉湯液離心3~4min,3000r/min,棄上清,沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗滌,再離心沉淀,棄上清。
(4)以沉淀涂片,直徑約1cm,涂兩個圓形區(qū)。
(5)將標本bhskgw.cn/yishi/放入95%酒精中固定1min,然后浸入PBS中洗1次,取出室溫晾干。
(6)直接法染色,左側標本作對照,加非溶血性鏈球菌熒光抗體染色。右側加甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色。置濕盒中孵育20~30min,再用PBS洗2次,每次5min,振動洗滌,濾紙吸干標本周圍的水。
(7)加緩沖甘油封裱,立即熒光顯微鏡觀察。
免疫熒光檢出的陽性率較培養(yǎng)法為高,因為前者可以檢出抗菌素治療后的死菌。二者符合率達95%。
(一)制備熒光抗體
可用多價和I、II、III、IV型單價的腦膜炎球菌抗血清,分別制備多價和單價熒光抗體。
(二)檢查方法
用患者咽拭子,腦脊液或培養(yǎng)標本制備涂片,晾干,火焰或乙醇固定,37℃中染色30min,熒光顯微鏡檢查。
抗腦膜炎雙球菌的熒光抗體有很高的特異性,可以快速檢出和鑒定腦膜炎雙球菌。有人應用免疫熒光檢查267例腦膜炎病人腦脊液中腦膜炎雙球菌,陽性率73.4%,培養(yǎng)和普通染色則只分別為41.9%和34.4%。
霍亂和副霍亂是嚴重的傳染病,快速診斷才能及早防治。取病人糞便標本直接涂片熒光抗體染色檢查,與常規(guī)培養(yǎng)法比較,具有快速特異和檢出率很高的優(yōu)點。尤其適用于急性期病人的診斷。
鼠疫是烈性傳染病,快速及時的診斷對于控制流行和救治病人有決定性意義,免疫熒光快速診斷方法是一種特異和敏感的手段。直接法和間接都可應用,以直接法更簡便。
炭疽也是一種烈性傳染病,早期快速診斷對救治病人有決定性意義。免疫熒光檢查方法對炭疽桿菌的檢出率很高。應用抗夾膜熒光抗體檢查炭疽桿菌有十分確定的診斷意義。也可用間接法檢測血清中抗夾膜抗體。
(1)制備當?shù)爻R姷闹虏⌒源竽c桿菌熒光抗體。
(2)取病人大便標本或直腸拭子以生理鹽水攪和涂片,晾干,火焰固定。
(3)直接法免疫熒光染色,立即熒光顯微鏡檢查。
由于本菌較其他非致病性大腸桿菌組有特殊的抗原,不易發(fā)生強交叉反應。所以,在兒童腸炎和引起人群暴發(fā)性腸炎時更準確、快速和簡便。
結核桿菌感染機體后可以誘導產生抗體,可用間接法檢查血、胸腹水和腦脊液中的抗體。
也可用抗結核桿菌的熒光抗體直接法檢查抗原。
對軍團桿菌、布氏桿菌、土拉桿菌、產氣夾膜桿菌等的快速診斷,效果良好。
(1)根據(jù)當?shù)劂^端螺旋體的型別制備多價抗體、標記FITC制成熒光抗體。
(2)檢查方法:
①血液標本的檢查:取發(fā)熱期的病人或發(fā)病動物的血液約2ml,制取血漿,并加入鉀明礬(0.058g/ml),振蕩混勻后置室溫10~15min,然后中速離心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫熒光染色,鏡檢。
②尿液標本檢查:取病人或動物尿液約2~3ml,高速離心,取沉渣涂片,無水乙醇固定,免疫熒光染色,鏡檢。
③臟器標本的檢查:取發(fā)病動物的腎臟皮質部分,以刀片切出整齊斷面,濾紙吸去血液,再以潔凈載玻片壓印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。經10%甲醛固定的組織可作冰凍切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,熒光抗體染色前以3%表面活性劑如Tween20處理切片,據(jù)稱,這樣可使熒光強度增加4倍。
④培養(yǎng)液檢查:同尿處理。
⑤特異性抗體的檢查:用適當血清型的鉤端螺旋體作抗原,用間接法檢查病人血清中的特異性抗體,可用于流行病學調查和臨床追溯診斷。此檢查適用于人類和家畜等。
本法診斷鉤端螺旋體,一般只具有屬的特異性,鑒定抗體則可能達到型的特異性。
免疫熒光細胞化學應用于梅毒血清學診斷有很多文獻報道。70年代應用PAP法又將敏感性提高了許多倍,此法已作為梅毒診斷的常規(guī)方法。用間接免疫熒光法可PAP法,取已知梅毒螺旋體作抗原,檢查病人血清中的特異性抗體。
(一)抗原制備
以標準株(如Nicol株)梅毒螺旋體感染家兔睪丸,約1周后待睪丸產生明顯炎癥,剖腹將睪丸摘除,仔細清除精索、附睪和包膜,然后以滅菌器械將其剪成薄片,置于燒瓶內,加入20ml生理鹽水,振蕩30min,使螺旋體逸出,2000r/min離心10min以除去組織碎塊和血細胞,將上清高速離心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理鹽水洗滌,再高速離心,洗滌,反復3次以上,以盡可能除去組織成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(內含0.01%硫柳汞或數(shù)滴福爾馬林以防腐)將沉淀制成敏感毫升約含10,000,000螺旋體的懸液,置4℃保存?zhèn)溆谩S行诩s半年。
(二)熒光抗體
用抗人IgG和IgM熒光抗體。為診斷新生兒先天性梅毒,必須用抗人IgM熒光抗體。
所有稀釋用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。
(三)間接免疫熒光染色方法(FIA試驗)
1.定性檢查先將待檢血清滅活。在載玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4個點,在室溫中晾干,丙酮固定10min。各點分別加-1:50稀釋待檢血清;②-1:200稀釋陽性血清;③-1:50稀釋陰性血清;④-PBS。放入濕盒,在37℃或室溫中放置20min,用PBS振蕩洗滌10min,再加適當稀釋的抗人IgG和IgM熒光抗體,再同上條件下放置20min,水洗,封裱,鏡檢。結果如①、②熒光陽性,③、④陰性,待檢血清即判斷為陽性。陽性時梅毒螺旋體呈明亮的黃綠色熒光,亦有人將待檢血清稀釋bhskgw.cn/rencai/1:200作定性檢查,這樣可排除低稀釋時正常人可出現(xiàn)的假陽性反應,此法又稱FTA-200試驗。
2.滴度測定如定性檢查陽性,則被檢血清應進一步稀釋成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑點以螺旋體發(fā)“++”熒光為標準。
(四)熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 簡稱FTA-ABS)
FTA-200試驗敏感性較差,有時查不出潛伏期和晚期梅毒。FTA-ABC試驗不但敏感性高,而且特異性更好。方法是將非致病性螺旋體Reiter株的培養(yǎng)液于121℃高壓加熱10min,然后高速離心、沉淀,取其上清浸液作為吸附劑,并用以稀釋病人血清(1:5),然后如上法(FTA試驗)進行染色檢查。
FTA-ABC所用的反復洗滌過的純梅毒螺旋體抗原,推薦置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化鎂和0.85%氯化鈉溶液(用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液pH6.8配制)中冰凍干燥保存,其中清蛋白起保護劑的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化鎂維持螺旋體的形態(tài)學,緩沖液穩(wěn)定pH。
(五)梅毒螺旋體的直接檢查法
取梅毒局部硬結滲出液涂片,用直接法或間接法免疫細胞化學染色,更容易發(fā)現(xiàn)隱藏在細胞碎片之間的螺旋體。免疫熒光檢出效果和暗視野檢一樣敏感。如用RB200標記牛清蛋白作初染色,圖像更為清晰。